CN107619878A - 一种五味子分子身份证及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种五味子分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将五味子与南五味子区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现五味子原植物、药材、种子、种苗、粉末及含五味子中成药的快速、准确鉴定。

Description

一种五味子分子身份证及鉴定方法

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种五味子分子身份证及鉴定方法。

背景技术

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实，形态与五味子相似。李时珍《本草纲目》谓：“五味子今有南北之分，南产者色红，北产者色黑，人滋补药必用北产者良”。同时现代研究中南、北五味子的果实中化学成分及含量差异很大，且市场中南五味子价格较便宜，常有南五味子作五味子用现象。所以，正确鉴别南、北五味子，对保证临床疗效和维持药材市场秩序有重要意义。本研究在大样本量数据分析的基础上，开发了一个26 bp的五味子特异的分子身份证序列。BLAST结果表明，此段序列为五味子所特有。如图2所示，以此26 bp序列进行BLAST，得到序列覆盖度及相似度为100％的结果有且仅有五味子，即若ITS2序列中存在该26 bp短序列，可判断为五味子，反之，则不是五味子。开发短的分子身份证序列的优势在于短序列易扩增，适合DNA已降解的中药材鉴定。因此，该分子身份证序列可以用来鉴定五味子原植物、药材、种子、种苗、粉末、含五味子中成药和混淆品。

发明内容

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的五味子鉴定方法。

为达到以上目的，本发明的发明人在对大量的样品的筛选过程中，寻找出能够将五味子与南五味子进行精确区分的特异分子身份证序列，并提供了对五味子鉴别较为快速，简便，廉价的方法。

具体的，本发明提供了一种五味子分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种五味子的鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在五味子成分或为五味子。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。

本发明对于PCR所使用的引物无特别的限制，只要能够对所述分子身份证进行扩增即可，为了获得最佳的鉴定效果，所述PCR扩增使用的引物为：

ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′(SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，

WWZ5R 5′-GCTCCTCGCAAACACCATAC-3′(SEQ ID No.3所示的核苷酸序列)。

可选的，所述PCR扩增的反应程序为：

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

所述待测样品的形式可以为植株、药材、种子、种苗及中成药，利用本发明所提供的方法可以对因加工而难以通过形态学鉴定进行区分的检测对象进行准确的鉴别，例如可以中成药样品进行鉴定。

本发明提供了所述方法或所述的分子身份证在鉴定五味子中的应用。

利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将五味子与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能够提取出DNA的五味子任何样品。因此，能够实现五味子原植物、药材、种子、种苗、粉末、混伪品和含五味子中成药的快速、准确鉴定。

附图说明

图1为五味子(Schisandra chinensis)特异分子身份证序列和南五味子序列的比对图

包含5‘-CGCTTTGCGACGCTCCCCTCCCTCCC-3’的比对图

图2为应用五味子(S.chinensis)含特异分子身份证的序列BLAST结果图

表1为五味子(S.chinensis)样品信息表

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1

实施例1用于说明五味子药材的鉴定方法

1)从北京、江苏、陕西、山西、吉林等省市以及安徽亳州、河北安国、四川荷花池等药材市场共收集到五味子S.chinensis共计47份，分别取80mg药材，在MM 400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

表1五味子样品信息表

2)PCR扩增

引物序列为ITS2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；WWZ5R：GCTCCTCGCAAACACCATAC，由生工生物工程股份有限公司(北京DNA合成部)合成。引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 2μL(约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

3)测序

PCR产物直接送至中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物为ITS2F和WWZ5R。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

4)序列拼接

本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 7.0.1(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。

5)序列比对

用MEGA 6软件对测序并拼接后的各个样品序列进行比对，如图2所示，所有五味子样品序列包含(SEQ ID No.1)CGCTTTGCGACGCTCCCCTCCCTCCC，而南五味子序列不包含此段序列，表明此段序列可特异性地用于五味子的鉴定。由于数据较多，图2仅显示了部分序列比对结果。五味子SEQ ID No.1序列无种内变异。

实施例2五味子基原植物的鉴定

采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以五味子基原植物为样品。从北京东灵山收集基原植物样本1份，提取DNA，进行鉴定。结果也能特异性地检测到五味子分子身份证。

实施例3五味子中成药的鉴定

采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以含五味子中成药为样品。从北京市药店购买含五味子中成药2份，提取DNA进行鉴定。结果也能特异性地检测到五味子分子身份证，可以实现对含五味子中成药的鉴定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.五味子分子身份证，其特征在于，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分子身份证，其特征在于，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.一种五味子的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1-2中任意一项所述的分子身份证。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测扩增片段中是否存在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

6.权利要求1-2所述的分子身份证序列或权利要求3-5中任意一项所述的鉴定方法在五味子鉴定中的应用。