CN108330205A

CN108330205A - 一种银杏保健品中掺杂槐角的鉴定方法

Info

Publication number: CN108330205A
Application number: CN201810232629.7A
Authority: CN
Inventors: 韩建萍; 韦学敏; 宋经元
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明涉及槐角分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的判定市场所售银杏叶保健品中是否掺杂槐角。本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现银杏叶提取物及主要标签成分为银杏叶提取物的保健品的快速、准确鉴定。

Description

一种银杏保健品中掺杂槐角的鉴定方法

技术领域

本发明属于中药来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种应用分子身份证鉴定银杏叶提取物、银杏叶保健品等产品中掺杂槐角的方法。

背景技术

银杏叶(Ginkgo folium)为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶。银杏提取物是以银杏的叶为原料，分离纯化提取的物质，其主要活性成分是黄酮和萜类内酯。现代药理研究表明，银杏黄酮和萜类内酯具有改善心血管系统，调血脂，抗氧化，抗衰老等作用。银杏叶提取物已成为国内外普遍使用的重要原料以及制剂之一。目前，中国食品药品监督管理局已经批准了数十种银杏叶提取物剂型，包括药品与保健食品，主要是银杏叶片、胶囊。根据《中华人民共和国药典》(2015版)银杏叶提取物含量测定项下相关要求，银杏叶提取物按干燥品计含总黄酮苷不得少于24.0％，含萜类内酯不得少于6.0％。黄酮类物质是银杏叶中主要药效成分，也是治疗心脑血管疾病主要活性成分。据报道，由于豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥成熟果实槐角(Sophorae fructus))中黄酮类化合物含量较高，故现今市场上许多不法商家在银杏叶产品中掺入槐角以提高银杏叶产品中黄酮类化合物的含量。传统的鉴定方法，如基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定等在提取物及其相关产品的鉴定中明显受限。现今对银杏叶保健品、提取物的鉴定和质量控制主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，但槐角与银杏叶均含有黄酮类化合物，故高效液相色谱法对银杏叶提取物及其相关产品的鉴定存在局限性。因此，急需建立一种银杏叶提取物及其相关产品中掺杂槐角的鉴定方法。

如今分子鉴定已广泛应用于中药材中，而针对提取物及其相关产品而言，DNA的提取会更加困难，扩增长序列存在一定的难度，或者扩增质量不佳影响鉴定结果。本发明开发了一段槐特异的分子身份证(序列)，片段长度为25bp，可以用于银杏叶提取物及其相关产品中掺杂的槐角的准确鉴定。本专利用于鉴定银杏叶提取物及其相关产品中是否掺杂槐角。

发明内容

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷并提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的银杏叶提取物及其相关产品中掺杂槐角的鉴定方法。本发明所利用的分子身份证是在大量的槐角ITS2序列中经过筛选和与BLAST比对后确定了一段25bp的槐分子身份证序列，该分子身份证具有种内保守、种间变异较大的特点。经过BLAST分析，证明该分子身份证为槐特有，种内序列相似度为100％(见图1)，与其它物种的序列相似度较低。若未知样品DNA扩增获得此段分子身份证，则可判定样品为槐角或含有槐角。

本发明提供了一种银杏提取物及其相关产品中掺杂槐角的分子鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在槐角。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物：

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证，如果含有此分子身份证，则证明该样品中存在槐角。

本发明对于PCR所使用的引物有特别的限制，仅为扩增出槐角，特异性较高，因此在PCR扩增的过程中为了达到目的条带的准确性，采用专门设计的特异引物。所述PCR扩增使用的引物为：

HM-1F：5′-TGTGTCTGTGGTGGAGAG-3′

HM-1R：5′-TCCGTGGGTCACATAGTC-3′

上述PCR扩增的反应程序为：

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

其中，所述待测样品为银杏叶提取物及主要标签成分为银杏叶提取物的保健品(药片、胶囊)。

附图说明

图1所示为槐(Sophora japonica)分子身份证5’-TCTCGAGACCAATCGCGTGTGTCTC-3’的比对结果。图2所示为槐角药材、银杏叶与槐角混合粉末、银杏叶提取物及其相关产品的扩增结果：利用特异性引物HM-1F/HM-1R在槐角药材、银杏叶与槐角混合粉末、银杏叶提取物及其相关产品DNA中扩增含有槐角分子身份证片段，样品共21个。1-5泳道为槐角目的条带(样品编号依次为H-1-H-5)，泳道6-9为银杏叶与槐角混合粉末的扩增结果(6为银杏叶：槐角混合比例为3∶8的混合粉末，7为银杏叶：槐角混合比例为1∶1的混合粉末，8为银杏叶：槐角混合比例为8∶3的混合粉末，9为银杏叶：槐角混合比例为10∶0的混合粉末)，泳道10-21为银杏叶提取物及主要标签成分为银杏叶提取物的保健品(药片、胶囊)的扩增结果，M为50bp DNA ladder，CK为阴性对照。

具体实施方式

实施例1 用于说明特异性引物扩增槐角的可行性

1)DNA的获取

从不同产地收集槐角的基原样本5份(表1)。分别取20mg，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

2)PCR扩增

正向引物HM-1F：5′-TGTGTCTGTGGTGGAGAG-3′

反向引物HM-1R：5′-TCCGTGGGTCACATAGTC-3′

由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

3)测序

PCR产物直接送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。测序引物为正向引物HM-1F：

5′-TGTGTCTGTGGTGGAGAG-3′和反向引物HM-1R：5′-TCCGTGGGTCACATAGTC-3′。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

4)序列拼接

本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 6.0.2(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。

5)同属近缘种序列比对

用MEGA 5.0软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中槐角ITS2序列进行比对，槐角药材样品的ITS2序列包含5’-GATAGCGGGGAGCAGCGGACATGGT-3’(图1)。

表1 样品表

实施例2 通过人工手段混合银杏叶和槐角药材粉末

采用与实施1相同的方法进行鉴定，所不同的是另采集银杏叶药材样本，与实施例1中的槐角药材均粉碎为粉末，对两种药材粉末进行人工混合，所混合比例为银杏叶：槐角分别为3∶8，1∶1，8∶3，和10∶0(表1)。提取混合药材粉末的DNA，应用特异引物HM-1F/HM-1R进行扩增(如图2，泳道6-9)并测序，在序列中查找槐角分子身份证。结果表明，在银杏叶：槐角混合比例为10∶0的样品中没有查找到槐角分子身份证，而在银杏叶：槐角混合比例为8∶3，1∶1，和3∶8的样品中均查找到槐角分子身份证，说明该方法适合于银杏叶样品中掺伪槐角的鉴定。

实施例3 利用槐角特异性引物对银杏叶提取物、银杏叶保健品中掺槐角的鉴定

采用与实施1相同的方法进行鉴定，所不同的是以银杏叶提取物、银杏叶保健品(片、胶囊)为样品，见表1。提取基因组DNA，应用特异引物HM-1F/HM-1R进行扩增，通过电泳检测目的条带。结果表明，12份样品中有3份样品检测出槐角目的条带(图2)，说明该方法适用于银杏叶提取物及其相关产品中掺槐角的鉴定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.槐角分子身份证鉴定方法，其包括如下步骤：

1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区，获得完整序列，确定包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种银杏叶提取物及主要标签成分为银杏叶提取物的保健品中掺杂槐角的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1中任意一项所述的槐角分子身份证，如果含有则可判断银杏叶保健品中掺有槐角。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：

HM-1F：5′-TGTGTCTGTGGTGGAGAG-3′

HM-1R：5′-TCCGTGGGTCACATAGTC-3′。

4.含有权利要求3中所述的引物的槐角鉴定试剂盒。