CN104830970A - 一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种冬虫夏草子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将冬虫夏草与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现冬虫夏草原药材及菌丝体的快速、准确鉴定。

Description

一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法
技术领域
本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种冬虫夏草分子身份证及鉴定方法。
背景技术
冬虫夏草(Ophiocordyceps Sinensis)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。是我国珍稀名贵中药材。由于冬虫夏草本身的生境特殊，生长缓慢，天然产量有限，加上生态环境的破坏和长期过度采挖，其自然资源逐渐枯竭。目前冬虫夏草价格比黄金还贵，市场上常出现其混伪品。如：古尼虫草C.gunnii，蝉花C.cicadae，蛹虫草C.militaris，下垂虫草O.nutans,罗伯茨虫草O.robertsii等。由于冬虫夏草与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对冬虫夏草与其近缘种的鉴定有一定困难。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将冬虫夏草药材加以鉴定区分。
现有的对冬虫夏草的传统鉴别方法在实际运用中要进行准确鉴别难度极大，且存在主观性大，通用性差，且对观察者经验要求高等缺陷。而分子鉴别手段比较准确可靠，但都需要测序或是大量PCR和电泳及后期数据处理，也不利于规模化标准化建立。
因此有必要开发一种结果准确且鉴定过程简便快速的冬虫夏草分子鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的冬虫夏草鉴定方法。
为达到以上目的，本发明的发明人在对大量的样品的筛选过程中，寻找出能够将正品冬虫夏草与混伪品进行精确区分的正品冬虫夏草的特异分子身份证序列，并提供了对冬虫夏草鉴别较为快速，简便，廉价的方法。
具体的，本发明提供了一种冬虫夏草分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
可选的，所述分子身份证为SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的序列。
在本发明的另一种实施方式中，所述分子身份证为SEQ ID No.2所示的序列。
本发明提供了一种冬虫夏草的鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。
可选的，所述方法包括如下步骤：
1)以待测样品基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。
当存在SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的片段时可以判定被测样品中存在冬虫夏草成分或为冬虫夏草。相反，如果既不存在SEQ ID No.1所示的片段也不存在SEQ ID No.2所示的片段时，判定被测样品为伪品。
本发明对于PCR所使用的引物无特别的限制，只要能够对所述分子身份证进行扩增即可，为了获得最佳的鉴定效果，所述PCR扩增使用的引物为：
ITSF 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQ ID No.3所示的核苷酸序列)，
ITSR 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)。
可选的，所述PCR扩增的反应程序为：
可选的，所述PCR扩增的反应体系为：
LATaq PCR buffer II(Mg2+Plus)(10×)2.5μL，dNTPs混合物1μL(2.5mmol/L)，引物各0.6μL(10μmol/L)，模板DNA 1μL(约30ng)，LA TaqDNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
其中，所述待测样品包括冬虫夏草及同属近缘种及伪混品。
所述待测样品的形式可以为药材和菌丝体，利用本发明所提供的方法可以对因加工而难以通过形态学鉴定进行区分的检测对象进行准确的鉴别，例如可以对粉末形式的样品进行鉴定。
本发明提供了所述方法或所述的分子身份证在鉴定冬虫夏草中的应用。
利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将冬虫夏草与形态特征相似的伪品区分开，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的冬虫夏草任何样品。因此，能够实现冬虫夏草原药材和菌丝体、粉末和混淆品的快速、准确鉴定。
附图说明
图1中图A和图B所示为冬虫夏草(O.Sinensis)的36个种内变异类型。
图2所示为冬虫夏草(Ophiocordyceps Sinensis)和其他物种ITS序列的比对结果，其中图A为包含5‘-AGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGC-3’(SEQ ID No.1所示的核苷酸序列)的比对图；图B为包含5‘-ACCCCGCCGCGGCTCCCCTGCGCAGT-3”(SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)的比对图。
冬虫夏草序列表中列出的为冬虫夏草(OphiocordycepsSinensis)的分子身份证。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
1)从不同产地收集的53份冬虫夏草O.sinensis和混淆品古尼虫草C.gunnii,蝉花C.cicadae,蛹虫草C.militaris,下垂虫草O.nutans,罗伯茨虫草O.robertsii样品，分别取20mg样品，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
2)PCR扩增
引物序列为ITSF 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITSR 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2μmol/μL。25μL反应体系：LATaq PCR buffer II(Mg2+Plus)(10×)2.5μL，dNTPs混合物1μL(2.5mmol/L)，引物各0.6μL(10μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，LA TaqDNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
3)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同本发明的ITSF和ITSR的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCodeCo.,Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，去除序列两端引物序列。从GenBank中下载冬虫夏草混伪品的ITS序列，完整的ITS序列用于后续分析。
5)序列比对
用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中冬虫夏草ITS序列进行比对，共获得2段SNP序列，所有冬虫夏草样品的ITS序列包含AGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGC或ACCCCGCCGCGGCTCCCCTGCGCAGT，而其他物种(古尼虫草C.gunnii,蝉花C.cicadae,蛹虫草C.militaris,下垂虫草O.nutans,罗伯茨虫草O.robertsii)序列不包含这2段SNP序列，表明这两段SNP位点可特异性地用于冬虫夏草的鉴定。这两段SNP序列存在于所有实验数据及GenBank数据中，由于数据较多，图2仅显示SNP序列比对结果。冬虫夏草存在较大种内变异，图1列出了冬虫夏草的36个种内变异类型，此2段SNP序列在冬虫夏草种内保守，故种内变异位点不影响冬虫夏草两个特异的SNP位点的鉴定。
实施例2冬虫夏草菌丝体的鉴定
采用与实施例1中相同的方法，所不同的是以冬虫夏草菌丝体为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的2段SNP位点。并且序列对比发现，冬虫夏草饮片DNA的ITS序列包含AGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGC和ACCCCGCCGCGGCTCCCCTGCGCAGT。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.冬虫夏草分子身份证，其特征在于，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子身份证，其特征在于，所述分子身份证为SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.一种冬虫夏草鉴定方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1-2中任意一项所述的分子身份证。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)以待测样品基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测扩增片段中是否存在SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
6.权利要求1-2所述的分子身份证序列或权利要求3-5中任意一项所述的鉴定方法在冬虫夏草鉴定中的应用。
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