CN105695460A - 一种快速检测冬虫夏草的试剂盒 - Google Patents

一种快速检测冬虫夏草的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SEQ ID NO：1～2所示的引物对，还公开了正品冬虫夏草的检测试剂盒及其用途。本发明特定的引物和试剂盒可以有效准确鉴定冬虫夏草的真伪，操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，稳定性和重复性良好，对市售冬虫夏草真伪鉴定结果准确可靠，可以替代传统检测方法。

Description

一种快速检测冬虫夏草的试剂盒
技术领域
本发明涉及快速检测冬虫夏草的试剂盒。
背景技术
冬虫夏草Cordyceps是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫虫体的干燥复合体，具有补肺益肾、止血化痰带的功效，用于治疗肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血等症，首载于《本草从新》，是我国名贵中药之一。《本草纲目拾遗》记载为“味甘性温，益气秘精，专补命门，功同人参”。而现代研究表明其具有抗氧化，免疫调节，抑制肿瘤，抗衰老，提高免疫力等作用。
冬虫夏草仅产于海拔3000米以上的高山草甸及灌木丛下，野生资源有限，然而市场需求巨大，导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重。常见混淆品有古尼虫草Cordycepsgunnii(Berk.)Berk、蛹虫草Cordycepsmilitaris、凉山虫草CordycepsliangshanensisZang，LiuetHu和蝉花IsariacicadaeMiquel等近缘属种，以及地蚕、白僵蚕等经非法加工染色处理后在形态上与冬虫夏草极其相似的伪品。采用传统的形态鉴别手段难以有效区分，加工品和粉末更是不易鉴别。
如何快速、有效地鉴别真伪，是保证冬虫夏草临床用药安全有效亟需解决的首要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种正品冬虫夏草的检测试剂盒。
本发明提供了SEQIDNO：1～2所示的引物对。
本发明正品冬虫夏草的检测试剂盒，它包括SEQIDNO：1～2所示的引物对。
所述试剂盒还包括2×TaqPCRmastermix。
所述试剂盒还包括琼脂糖凝胶电泳检测用试剂或者荧光检测用试剂。其中，所述荧光检测用试剂为100×SYBRGreenI。
所述试剂盒它还包括提取待检样本DNA的试剂。所述提取待检样本DNA的试剂为碱裂解法用试剂。所述碱裂解法用试剂包括如下试剂：添加1％(v/v)的浓度为1％的TritonX-100溶液、1％(w/v)PVP-40的浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液，0.1MTris-HCl溶液。
本发明还提供了前述试剂盒在检测冬虫夏草中的用途。其中，所述待检样本为冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草和/或蝉花。
本发明特定的引物和试剂盒可以有效准确鉴定冬虫夏草的真伪，操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，稳定性和重复性良好，对市售冬虫夏草真伪鉴定结果准确可靠，可以替代传统检测方法。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1冬虫夏草特异引物扩增。M:DL2000maker；1～2：冬虫夏草；3～4：凉山虫草；5～6：古尼虫草；7～8：蛹虫草；9：蝉花；10：阴性对照；
图2特异引物荧光检视。M:DL2000maker；1～2：冬虫夏草；3～4：凉山虫草；5～6：古尼虫草；7～8：蛹虫草；9：蝉花；CK：阴性对照；
图3试剂盒保存期考察。CK3:37℃温育3天空白对照；PC3:37℃温育3天阳性；CK7:37℃温育7天空白对照；PC3:37℃温育7天阳性；
图4试剂盒批内重现性。PC：阳性对照，CK：阴性对照；1，2，3：表明不同操作条件；
图5试剂盒批间重现性。PC：阳性对照；CK：阴性对照；1，2，3：表明不同批次试剂盒；
图6市售冬虫夏草试剂盒检测结果。
具体实施方式
实验试剂和仪器
氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)购自成都市科龙化工试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-aldrich)；核酸染料gelview购自北京百泰克生物有限公司(Bioteke)；琼脂糖、2×TaqPCRmastermix、6×Loadingbuffer、DNAmaker购自天根生化科技(北京)有限公司，TritonX-100，购自上海索莱宝生物科技有限公司，PVP-40，购自上海江莱生物科技有限公司，100×SYBRGreenI，购自英潍捷基(上海)股份有限责任公司。
HHS-S恒温金属浴，上海光地仪器设备有限公司；ND2000微量核酸蛋白测定仪，美国Thermo中国公司；IcyclePCR扩增仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司(BIO-RAD)；GELDOCEQ凝胶成像系统，伯乐生命医学产品(上海)有限公司(BIO-RAD)；DYY-III-12B型核酸电泳仪，北京六一仪器厂；WH-2微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；ZF-1三用紫外分析仪，上海驰唐电子有限公司。
实验材料：
表1中的材料均由成都中医药大学国锦琳教授鉴定，凭证标本保存于成都中医药大学中药资源与鉴定实验室。
表1样品信息表
物种 采集地 鉴定人
冬虫夏草Cordyceps sinensis 四川甘孜 国锦琳
蛹虫草C.militaris 四川绵阳 国锦琳
古尼虫草C.gunni 湖南常德 国锦琳
凉山虫草C.liangshanensis 四川雷波 国锦琳
蝉花C.cicadae 四川成都 国锦琳
表2中的所有材料均由成都中医药大学国锦琳教授鉴定，凭证标本保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。
表2样本信息表
实验例1本发明检测试剂盒及其使用方法
一、试剂盒的组成和使用
1、本发明试剂盒
(1)试剂盒的组成
将所用试剂按如下方式组装成试剂盒(表1)规格为50次/盒。以正品冬虫夏草模板DNA(100ng·μL-1)为阳性对照，同时以无菌ddH2O水为阴性对照。
表3试剂盒组装规格
材料 规格 数量 贮藏方式
Buffer A 0.5M NaOH 10mL/瓶 1瓶 常温
Buffer B 0.1M Tris-HCL 20mL/瓶 1瓶 常温
Postive Control 100ng·μL-1 30μL/管 1管 -20℃冻存
Primer premix 引物预混液 60μL/管 1管 -20℃冻存
Taq master mix 2×Taq PCR master mix 750μL/管 1管 -20℃冻存
Buffer C 100×SYBR Green I 120μL/管 1管 -20℃避光冻存
ddH20 灭菌超纯水 1mL/管 2管 -20℃冻存
其中，引物预混液包括引物和ddH20，单条引物的浓度为0.2mol/L，引物为SI-F6和SI-R6。SI-F6:5’-TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT-3’，SI-R6:5’-GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC-3’。该对引物的扩增片段长度为174bp。引物由英潍捷基(上海)股份有限责任公司合成，选择PAGE纯化。
PostiveControl是正品冬虫夏草。
(2)试剂盒的适用范围
本试剂盒适用于市售冬虫夏草药材、冬虫夏草粉末、冬虫夏草含片、以冬虫夏草药粉入药的中成药等真伪鉴定，适于在中药材市场、药店、中药材企业以及药品监督管理部门使用。
(3)试剂盒中不提供但实验需要的材料
PCR仪，20～200μL移液器、1～10μL移液器、配套枪头，1.5mL灭菌离心管，PCR管，紫外灯。
2、试剂盒的使用方法
(1)采用本发明试剂盒检测冬虫夏草的方法
取冬虫夏草，使用碱裂解法快速提取总DNA。
碱裂解法快速提取总DNA的方法为：取冬虫夏草样品粉末10mg于1.5mLEP管中，加入80μL碱裂解液(0.5mol·L-1的NaOH，1％(v/v)的1％TritonX-100，1％(0.01g/ml)的PVP-40)涡旋混匀，100℃孵育30s；加入200μL0.1MTris-HCl(pH＝8.0)涡旋混匀后，12000rpm离心5min；取上清液200μL，作模板DNA备用。
使用通用引物ITS4/ITS5(ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3；ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')对模板DNA的质量进行检测。
PCR反应体系为25μL，其中包含10μL2×TaqPCRmastermix、引物1μL模板1μL，ddH2O补足至25μL。反应在BIO-RAD公司的Icycler型PCR仪上进行。
反应结束后，取5μL扩增产物与1μL6×Loadingbuffer混匀后用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统拍照观察并保存；或者取20μL扩增产物，加入2μL100×SYBRGreenI混匀后，置紫外灯下观察。
二、试剂盒的性能检测
1、试剂盒的性能
1)特异性检验
分别以凉山虫草，古尼虫草，蛹虫草，蝉花的DNA为模板，以冬虫夏草DNA为阳性对照，检验冬虫夏草特异片段扩增引物SI-F6和SI-R6的种特异性。反应体系为25μL其中包括，模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL。反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。反应在Icycler型PCR仪(BIO-RAD)上进行。反应结束后，取5μL反应产物加入1μL6×Loadingbuffer混匀后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)拍照观察并保存。
2)灵敏度检测
取冬虫夏草DNA，对模板进行稀释，稀释后进行检测。反应体系为25μL其中包括，模板1μL，2×TaqPCRmastermix12.5μL，引物1μL，ddH2O补足至25μL。反应程序：94℃预变性1min；94℃变性30s，67℃复性30s，共30个循环。反应在Icycler型PCR仪(BIO-RAD)上进行。反应结束后，取5μL反应产物加入1μL6×Loadingbuffer混匀后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)拍照观察并保存。
3)试剂盒准确性考察
采用本试剂盒，双盲随机编号后对30份不同产地正品冬虫夏草，20份伪品，包括凉山虫草5份，古尼虫草5份，蛹虫草5份，蝉花5份，进行测定，记录其阳性和阴性，统计其准确性和真实性。
4)试剂盒的保存期考察
参考生物制剂保存期加速破坏试验，37℃保存3天后仍有活性，表明该试剂盒能在4～8℃保存6个月，37℃保存7天后仍有活性，表明该试剂盒能在4～8℃保存1年，本研究将试剂盒置于37℃3天、7天后取出对阳性对照和阴性对照进行检测，以考察试剂盒的保存期。
5)重复性实验
随机取同批次组装的试剂盒三盒，分别在不同操作试剂及不同操作条件下(不同操作人员、不同操作地点以及不同型号的仪器)下，采用本试剂盒进行鉴定，考察批内重复性。
随机选取3盒不同批次的试剂盒，在相同的试验条件下对阳性对照和阴性对照进行检测，根据其紫外下是否发绿色荧光，判定其批间重复性，考察批间重复性。
2、试剂盒的实际应用
采用该试剂盒，对市售冬虫夏草12份，伪品6份，金针虫草6份进行检测。
三、检测结果
1、引物特异性验证
本研究针对冬虫夏草ITS序列共设计了9对引物，最后筛选获得特异性最强的快速鉴定引物1对。采用该引物同时扩增不同产地的冬虫夏草和4种常见混伪品，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，仅冬虫夏草扩增出条带，4种常见混伪品均未扩增出条带(图1)。在扩增产物中加入2μL100×SYBRGreenI，混匀后在紫外下检测，冬虫夏草显示出明亮的绿色荧光，而混伪品不发出荧光(图2)。
2灵敏度检测
实验结果现实，在DNA模板浓度为10ng/ml及以上时，可扩增出目的条带，在DNA模板浓度小于1ng/ml时，扩增条带不清晰。
3试剂盒准确性考察
对随机双盲的正品冬虫夏草及其混伪品采用本试剂盒进行检验，形态鉴定为正品的30份冬虫夏草，采用本试剂盒进行检验，有26份样品为阳性，4份为假阴性。采用本试剂盒对冬虫夏草鉴定的总符合率92％，其中阳性符合率87％，阴性符合率100％，见表4。
表4试剂盒准确性考察
4试剂盒的保存期
试剂盒中NaOH和Tris-HCl在常温下性质稳定，而引物、含有DNATaq酶和dNTP的2×TaqPCRmastermix需在-20℃冻存以保持活性。试剂盒的保质期表现了试剂盒在未经使用时本身的稳定性，本研究参考药典规定的生物制剂试剂盒的加速稳定性试验，测试结果如图3所示，37℃温育3天，取出对阳性对照和阴性对照进行检测，阳性对照仍能有效扩增，37℃温育7天，取出对阳性对照和阴性对照进行检测，阳性对照仍能有效扩增，表明在1年内该试剂盒稳定有效。
5试剂盒重复性实验
于2015年12月19日组装的试剂盒中随机选取三盒，在不同操作时间、地点、人员、仪器下进行阳性对照和以ddH2O为模板的阴性对照进行鉴定测试。结果表明，3个试剂盒，冬虫夏草正品在紫外下均显示绿色荧光，阴性对照均无绿色荧光(图)。说明不同条件下操作结果一致，批内重复性好。不同时间组装的试剂盒在相同的操作条件下进行阳性样品和阴性样品的，结果表明不同批次的试剂盒在相同条件下阳性样品均能显示绿色荧光，阴性样品均不显示绿色荧光。说明不同批次的试剂盒可重复性好(图5)。
6试剂盒应用结果
如图6所示，对市售12份冬虫夏草，6份伪品虫草和6份金针虫虫草采用试剂盒鉴定，12份冬虫夏草均出现绿色荧光，6份伪品虫草，6份金针虫虫草无荧光。
综上，本发明特定的引物和试剂盒可以有效准确鉴定冬虫夏草的真伪，操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，稳定性和重复性良好，对市售冬虫夏草真伪鉴定结果准确可靠，采用采用SYBRGreenI荧光检视进行检视，整个检验过程可在80min内完成，极大地节约了时间，应用前景良好。

Claims (10)

1.SEQIDNO：1～2所示的引物对。
2.一种正品冬虫夏草的检测试剂盒，其特征在于：它包括SEQIDNO：1～2所示的引物对。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括2×TaqPCRmastermix。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括琼脂糖凝胶电泳检测用试剂或者荧光检测用试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述荧光检测用试剂为100×SYBRGreenI。
6.根据权利要求2～5任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括提取待检样本DNA的试剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：所述提取待检样本DNA的试剂为碱裂解法用试剂。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述碱裂解法用试剂包括如下试剂：添加1％(v/v)的浓度为1％的TritonX-100溶液、1％(w/v)PVP-40的浓度为0.5mol·L-1的NaOH溶液，0.1MTris-HCl溶液。
9.权利要求2～8任意一项所述试剂盒在检测冬虫夏草中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述待检样本为冬虫夏草、蛹虫草、古尼虫草、凉山虫草和/或蝉花。
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