CN104630201A

CN104630201A - 药材快速dna提取试剂盒

Info

Publication number: CN104630201A
Application number: CN201310548185.5A
Authority: CN
Inventors: 黄璐琦; 袁媛; 蒋超; 李曼; 南铁贵
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明公开了一种药材快速DNA提取试剂盒，属于分子生物学领域，涉及中药及中药材鉴定领域。本发明提供的试剂盒包含溶液A、B以及试剂C和使用手册；溶液A由溶液A由溶质曲拉通100(tritonX-100)和溶剂水组成，所述溶质及其在溶液A中最终浓度为1％。所述溶液B由溶质1M Tris-HCl和溶剂水组成，溶液B中Tris-HCL的浓度为1M，pH＝8.0。所述溶质及其在溶液B中的最终浓度为0.1M。所述试剂C由NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，M＝40)组成，NaOH在溶液A中最终浓度为0.5M，PVP为1％。本产品是针对药材快速鉴别开发的药材基因组DNA提取产品，可以用于植物、动物药材基因组DNA的快速提取。具有操作步骤少、提取速度快、价格低廉、不需要大型仪器、可大规模高通量提取等优点，非常适合用于药材DNA的快速检测与鉴定。

Description

药材快速DNA提取试剂盒

技术领域

本发明涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种药材快速DNA提取试剂盒。属于分子生物学技术领域

背景技术

长期以来DNA的提取一直是DNA分析技术实验中最耗时、繁琐的步骤，严重制约分子鉴定方法的使用和推广。为达到快速提取DNA的目的，研究者先后提出了ROSE法、磁珠吸附法、Tris-EDTA提取法等用于植物DNA的提取。尽管这些方法缩短了DNA提取的时间，但由于其仍然使用了加热、高速离心、沉淀等步骤，依然无法实现快速简便提取DNA的目的。其中DNA碱裂解法被认为是一种有效的DNA快速提取方法，已广泛用于小麦、玉米、花生、水稻等，在分子辅助育种、转基因植物鉴定、SSR鉴定等中起到了重要作用。DNA碱裂解法通过0.2-1.0M的氢氧化钠或氢氧化钾处理植物材料，裂解细胞并获得DNA，具有方法简单、操作步骤少、不需要使用酚等有毒试剂的特点。但由于植物材料差异巨大，难以找到通用的碱裂解剂配方，此外目前还未见使用碱裂解法提取中药材的报导。本发明建立了利用碱裂解法加入新型添加剂曲拉通100(TritonX-100)和适合快速提取药材DNA的中和试剂快速提取药材DNA。

发明内容

本申请目的是提供一种药材快速DNA提取的方法，该DNA提取方法操作步骤少、提取速度快、价格低廉、不需要大型仪器、可大规模高通量提取，可以用于植物、动物药材基因组DNA的快速提取。

1.一种药材快速DNA提取试剂盒，该试剂盒包括提取缓冲液、中和缓冲液、使用手册，其中所述提取缓冲液包含溶液A和试剂C，其中溶液A由溶质曲拉通100(tritonX-100)和溶剂水组成，试剂C由NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，M＝40)组成；所述中和缓冲液包含溶液B，所述溶液B由溶质1M Tris-HCl和溶剂水组成。

2.所述的提取缓冲液包含溶液A和试剂C，所述溶液A由溶质曲拉通100(tritonX-100)和溶剂水组成，所述溶质及其在溶液A中最终浓度为1％；所述试剂C由NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，M＝40)组成，NaOH在溶液A中最终浓度为0.5M，PVP为1％。

3.所述的中和缓冲液包含溶液B，所述溶液B由溶质1M Tris-HCl和溶剂水组成，溶液B中 Tris-HCL的浓度为1M，pH＝8.0；所述溶质及其在溶液B中的最终浓度为0.1M。

4.所述的试剂盒，其特征在于其非常适用于药材的DNA的快速检测与鉴定，使用此试剂盒获得的DNA片段长度一般在1Kb左右，适合进行500bp左右片段的扩增反应，DNA浓度为354.87士154.96ng/μL，A260/A230值为1.17士0.24。

5.一种快速提取药材DNA的方法，具体包括如下步骤：

(1)将试剂C溶于溶液A，

(2)将提取缓冲液与药材粉末充分混匀，加入中和缓冲液，混匀，离心，取上清液，

(3)将中和缓冲液与步骤(2)所得的上清液混匀，离心，取上清液即为快速提取的药材DNA。

6.根据5所述的快速提取药材DNA的方法，其特征在于提取缓冲液应将试剂C溶于溶液A，待完全溶解后使用，有效期为20天。

7.根据5所述的快速提取药材DNA的方法，其特征在于药材粉末的量为10-25mg，加入提取缓冲液的量为200μL，步骤(2)加入中和缓冲液的量为800μL，步骤(3)中加入中和缓冲液的量为500μL。

8.根据5所述的快速提取药材DNA的方法，其特征在于所述离心为12000rpm，离心1min。

9.本发明建立了利用碱裂解法快速提取药材DNA的试剂盒，利用所提供的试剂盒，不需要单独配制任何试剂，操作人员无需特殊培训即可掌握DNA提取的方法，可用于中药材生品和炮制材料DNA的提取，对于动物和植物药材均具有良好的效果，提取的中药材DNA可用于PCR反应。

附图说明

图1：用本产品提取蛇类药材基因组DNA，并利用通用引物ColI进行PCR反应，取5μL检测。M为DL2000Marker，N：阴性对照；1：乌梢蛇；2：金钱白花蛇；3：王锦蛇；4：赤链华游蛇

图2：用本产品提取植物类药材基因组DNA，并利用通用引物psbA-trnH进行PCR反应，取5μL检测。M：DL2000Marker；N：阴性对照；1：郁金；2：合欢皮；3：当归；4：金银花；5：人参；6：车前子；7：防风；8：广藿香；9：红花；10：苦参；11：辛夷；12：预知子；13：丹参；14：延胡索；15：桔梗；16：浙贝母；17：白芍；18：鸭趾草；19：首乌藤；20：山药；21：党参。

具体实施方式

下述的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从药店和商业途径得到。

实施例1

1、蛇类药材DNA快速提取

一种药材DNA快速提取试剂盒，包括提取缓冲液(溶液A、试剂C)、中和缓冲液(溶液B)和使用手册。其中溶液A为1％的tritonX-100水溶液，溶液B为0.1M的Tris-HCl水溶液，试剂C为NaOH和PVP。使用此试剂盒进行蛇类药材的DNA快速提取，步骤如下：

(1)将试剂C(0.08gNaOH、0.04gPVP)溶于溶液A(4mL)中，配成DNA提取缓冲液，完全溶解后待用。

(2)取乌梢蛇、金钱白花蛇、玉锦蛇、赤链华游蛇的干燥药材各25mg，分别放入2mL离心管里，编号后使用球磨仪约5min将药材研磨成粉，待用。

(3)分别向4份样品中加入200μLDNA提取缓冲液，漩涡振荡充分混匀。

(4)分别向4份样品中加入800μL溶液B，漩涡振荡充分混匀，12000rpm离心1min或静置10min。

(5)取500μL上清至一新的2mL离心管内，再分别加入500μL溶液B，漩涡振荡充分混匀。-20℃保存或稀释10-100倍用于PCR反应。

2、扩增检测

使用通用引物CoII，按照如下体系扩增：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP10mmol.L^-1，1.0μL)，正反引物各10μmol.L^-10.25μL，rTap酶5U.μL^-10.2μL，DN A20ng(1μL)，灭菌蒸馏水20μL。反应条件：95℃预变性5min后，95℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸5min，获得PCR产物。

取5μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，用D L2000DNA marker做参照，在电压100-150V下电泳10-15分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。见图1。

实施例2

1、植物类类药材DNA快速提取

(1)将试剂C(0.2g NaOH、0.1g PVP)溶于10mL溶液A(1％的tritonX-100水溶液)中，配成DNA提取缓冲液，完全溶解后待用。

(2)取郁金、合欢皮、当归、金银花、人参、车前子、防风、广藿香、红花、苦参、辛夷、预知子、丹参、延胡索、桔梗、浙贝母、白芍、鸭趾草、首乌藤、山药、党参的干燥药材各25mg，分别放入2mL离心管里，编号后使用球磨仪约5min将药材研磨成粉，待用。

(3)分别向21份样品中加入200μLDNA提取缓冲液，漩涡振荡充分混匀。

(4)分别向21份样品中加入800μL溶液B(0.1M的Tris-HCl水溶液)，漩涡振荡充分混匀，12000rpm离心1min或静置10min。

2、扩增检测

使用通用引物psbA-tmH，按照如下体系扩增：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP10mmol.L^-1，1.0μL)，正反引物各10μmol.L^-10.25μL，rTap酶5U.μL^-10.2μL，DNA20ng(1μL)，灭菌蒸馏水20μL。反应条件：95℃预变性5min后，95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，40个循环后72℃延伸5min，获得PCR产物。

取5μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，用D L2000DNA marker做参照，在电压100-150V下电泳10-15分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。见图2。

Claims

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的提取缓冲液包含溶液A和试剂C，所述溶液A由溶质曲拉通100(tritonX-100)和溶剂水组成，所述溶质及其在溶液A中最终浓度为1％；所述试剂C由NaOH和聚乙烯吡咯烷酮(PVP，M＝40)组成，NaOH在溶液A中最终浓度为0.5M，PVP为1％。

3.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述的中和缓冲液包含溶液B，所述溶液B由溶质1M Tris-HCl和溶剂水组成，溶液B中Tris-HCL的浓度为1M，pH＝8.0；所述溶质及其在溶液B中的最终浓度为0.1M。

4.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于其非常适用于药材的DNA的快速检测与鉴定，使用此试剂盒获得的DNA片段长度一般在1Kb左右，适合进行500bp左右片段的扩增反应，DNA浓度为354.87±154.96ng/μL，A260/A230值为1.17±0.24。

5.一种快速提取药材DNA的方法，其特征在于采用权利要求1-4中任一项权利要求所述试剂盒提取药材DNA，具体包括如下步骤：

(1)将试剂C溶于溶液A，

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于提取缓冲液应将试剂C溶于溶液A，待完全溶解后使用，有效期为20天。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于药材粉末的量为10-25mg，加入提取缓冲液的量为200μL，步骤(2)加入中和缓冲液的量为800μL，步骤(3)中加入中和缓冲液的量为500μL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述离心为12000rpm，离心1min。