CN103409515B - 一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法，试剂盒包括以下分离包装的试剂：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照；使用方法包括DNA提取、PCR扩增和酶切鉴定。本发明的试剂盒及其使用方法可以从分子水平鉴定斑点叉尾鮰物种，操作简单易行、快速实用，所耗时间短暂，无论完整的斑点叉尾鮰鱼体还是已加工好的成品或半成品，均可快捷方便地鉴别出斑点叉尾鮰物种，极其适合对进出口贸易中斑点叉尾鮰物种进行快速鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法，属于分子生物学PCR遗传鉴定领域。
背景技术
斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦称沟鲶（Channel Catfish），属鲶形目（Siluriformes）、鮰科（Ictaluridae）、叉尾鮰属（Ictalurus）。它原产于北美，其自然分布区在美国中部、加拿大南部和墨西哥北部。斑点叉尾鮰属名贵淡水经济鱼类，深受美国、加拿大及其它许多国家消费者的喜爱。加工好的成品或半成品在美国、日本、欧洲和加拿大等地市场均很畅销，市场需求量极大。自1984年，我国湖北省水产研究所首次引进斑点叉尾鮰，随着繁育、养殖以及加工技术的日趋成熟，再加上高额的投资回报效益，使得斑点叉尾鮰的养殖业和加工业在我国迅速蓬勃发展，出口创汇效益也逐年攀升。
近年来，曾被美国政府视为“反倾销”而遭封杀的越南巴沙鱼贴着“中国斑点叉尾鮰”的标签进入美国市场，这不但严重损害我国斑点叉尾鮰的品牌，影响了我国斑点叉尾鮰产品的正常出口，而且扰乱了国际斑点叉尾鮰市场，我国出口企业因被美国以物种不符为由多次退货遭受巨大经济损失。作为主要依托科技手段保障经贸发展的出入境检验检疫部门也已经面临一项全新的任务和挑战。
对于已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，由于形态已发生完全改变，主要依据骨骼结构和外部形态特征的传统物种鉴定方法在斑点叉尾鮰的物种鉴定上已完全不适用。此外，在成品和半成品中，由于细胞结构的破坏和蛋白质的严重变性，依据染色体特征的细胞分类学方法以及依据同功酶数据的酶学鉴定方法等也同样不适合斑点叉尾鮰的物种鉴定。
随着PCR技术和DNA测序技术的日趋成熟，通过DNA序列信息了解物种之间的遗传分化变得越来越普遍。线粒体DNA以其进化速率快，遵循母系遗传等特点，成为种群遗传学研究的有效标记之一。有关科技查新结果表明，国外已有线粒体DNA的PCR-RFLP的数据进行鳕鱼、比目鱼等制品中物种鉴定的报道，但均没有线粒体DNA的D-loop区的分子数据来进行斑点叉尾鮰物种鉴定方面的报道。而且PCR-RFLP方法操作过程繁琐，多用于对同一物种的不同群体进行遗传多态性分析，不适于快速、经济的鉴定斑点叉尾鮰物种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒及其使用方法，解决现有技术的不足，利用已加工好的斑点叉尾鮰成品和半成品，快捷方便的鉴别出斑点叉尾鮰物种。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，包括以下分离包装的试剂：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照；
所述裂解液PH值为8，包括以下组分：200mmol/L NaCl、20mmol/LTris-HCl、50mmol/L EDTA、1%SDS，其余为水；
所述抽取液Ⅰ包括苯酚、氯仿和异戊醇，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1；
所述抽取液Ⅱ包括氯仿和异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；
所述PCR反应液包括以下组分：10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、上游引物、下游引物、Taq DNA聚合酶，其余为超纯水；具体引物序列为：
上游引物：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
下游引物：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；
所述酶切反应液包括10×Buffer和EcoR Ⅰ；
所述阳性对照为PCR扩增后已酶切鉴定过的斑点叉尾鮰D-loop标准样品（即已知的斑点叉尾鮰物种D-loop进行PCR扩增和酶切之后得到的产物结果）；
所述阴性对照为PCR扩增后未酶切的斑点叉尾鮰D-loop标准样品（即已知的斑点叉尾鮰物种D-loop进行PCR扩增不进行酶切得到的产物结果）。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述PCR反应液中，含有10×PCR Buffer2.5μl、MgCl22.0μl、dNTPs2.0μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.5μl，以及超纯水16μl。
进一步，所述酶切反应液中，含有10×Buffer2.0μl和EcoRⅠ1.0μl。
进一步，所述裂解液室温存放，所述抽取液Ⅰ和抽取液Ⅱ贮藏于4℃，PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照贮藏于-20℃。
本发明解决上述技术问题的另一技术方案如下：一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：
1）取待检测样本0.08～0.12g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于50～60℃水浴中孵育1h～2h，得到混合液；
2）向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
3）向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
4）向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
5）向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；
6）将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；
7）将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：
1）于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；
2）取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；
3）将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；
4）所得的PCR产物置于冰上即可使用，或置于-20℃备用；
步骤三，酶切鉴定：
1）取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2～3h，得到酶切产物；
2）将上述酶切产物和阳性对照及阴性对照进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果以鉴定待测样品是否为斑点叉尾鮰。
本发明的有益效果是：线粒体DNA控制区具有个体和种群特异性，因此已被国际上广泛地用来作为物种鉴定的标准，尤其是D-loop控制区，不同物种差异较大，可以准确鉴定物种，在对D-loop测序的基础上，寻找其酶切位点，并进行酶切鉴定，不需测序即可简单地鉴定出斑点叉尾鮰物种。本发明的试剂盒可以快捷简单的完成上述步骤，从分子水平鉴定斑点叉尾鮰物种，操作简单易行、快速实用，所耗时间短暂，极其适合对进出口贸易中斑点叉尾鮰物种进行快速鉴定。
附图说明
图1为本发明随机样品以及阳性对照、阴性对照琼脂糖凝胶电泳图，其中c1为阴性对照，c2为阴性对照，10、27、30、34、42为随机选取的样品编号。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，每个试剂盒可检测10个样本，所述试剂盒包括以下分离包装的试剂：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照；
所述裂解液PH值为8，包括以下组分：200mmol/L NaCl、20mmol/LTris-HCl、50mmol/L EDTA、1%SDS，其余为水；所述裂解液每次使用500μl，每个试剂盒内一共含有5ml；室温存放。
所述抽取液Ⅰ包括苯酚、氯仿和异戊醇，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1；将50ml苯酚、48ml氯仿和2ml异戊醇混合，得到100m抽取液Ⅰ；所述抽取液Ⅰ每次使用1ml，每个试剂盒内一共含有10ml；4℃贮藏；
所述抽取液Ⅱ包括氯仿和异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；将96ml氯仿和4ml异戊醇混合，得到100m抽取液Ⅱ；所述抽取液Ⅱ每次使用500μl，每个试剂盒内一共含有5ml；4℃贮藏；
所述PCR反应液包括以下组分：2.5μl10×PCR Buffer、2.0μl MgCl2、2.0μl dNTPs、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl Taq DNA聚合酶，以及超纯水16μl；所述PCR反应液每次使用24μl，每个试剂盒内一共含有240μl；-20℃贮藏；
具体引物序列为：
上游引物：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
下游引物：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；
所述酶切反应液包括2.0μl10×Buffer和1.0μl EcoR Ⅰ，所述酶切反应液每次使用3μl，每个试剂盒内一共含有30μl；-20℃贮藏；
所述阳性对照为PCR扩增后已酶切鉴定过的斑点叉尾鮰D-loop标准样品，所述阳性对照每次使用5μl，每个试剂盒内一共含有50μl；-20℃贮藏；
所述阴性对照为PCR扩增后未酶切的斑点叉尾鮰D-loop标准样品，所述阴性对照每次使用5μl，每个试剂盒内一共含有50μl；-20℃贮藏。
随机选取待出口的斑点叉尾鮰半成品50个，对样品进行编号1～50，随机选取5个样品，进行以下实验。
实施例1
步骤一，DNA提取：取10号待检测样本0.1g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于53℃水浴中孵育1.5h，得到混合液；向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；所得的PCR产物置于冰上准备直接使用；
步骤三，酶切鉴定：取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2.5h，得到酶切产物；将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
实施例2
步骤一，DNA提取：取27号待检测样本0.08g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于50℃水浴中孵育1h，得到混合液；向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；所得的PCR产物置于冰上准备直接使用；
步骤三，酶切鉴定：取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2h，得到酶切产物；将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
实施例3
步骤一，DNA提取：取30号待检测样本0.12g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于60℃水浴中孵育2h，得到混合液；向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；所得的PCR产物置于冰上准备直接使用；
步骤三，酶切鉴定：取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育3h，得到酶切产物；将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
实施例4
步骤一，DNA提取：取34号待检测样本0.09g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于55℃水浴中孵育1.3h，得到混合液；向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；所得的PCR产物置于冰上准备直接使用；
步骤三，酶切鉴定：取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2.3h，得到酶切产物；将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
实施例5
步骤一，DNA提取：取42号待检测样本0.11g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于58℃水浴中孵育1.8h，得到混合液；向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；将离心后的溶液用体积分数为70%的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；所得的PCR产物置于冰上准备直接使用；
步骤三，酶切鉴定：取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2.8h，得到酶切产物；将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
阴性对比实施例
将阴性对照进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
阳性对比实施例
将阳性对照进行琼脂糖凝胶电泳，所得结果见图1。
结果分析：如图1所示，c1为阴性对照，没有被酶切成两段，其所在位置1为1162bp；c2为阳性对照，被酶切成两段，10、27、30、34、42为随机选取的样品编号，也被酶切成了两段，长的一段所在位置2为961bp，短的一段所在位置3为201bp。经斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒的检测，随机选取的五尾样品均属斑点叉尾鮰物种。由实验结果可以看出，斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，对斑点叉尾鮰物种的鉴定的特异性非常高，检出率可达到100%，完全适用于进出口斑点叉尾鮰的鉴定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，其特征在于，包括以下分离包装的试剂：裂解液、抽取液Ⅰ、抽取液Ⅱ、PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照；
所述裂解液PH值为8，包括以下组分：200mmol/L NaCl、20mmol/LTris-HCl、50mmol/L EDTA、1％SDS，其余为水；
所述抽取液Ⅰ包括苯酚、氯仿和异戊醇，其中苯酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1；
所述抽取液Ⅱ包括氯仿和异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；
所述PCR反应液包括以下组分：10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、上游引物、下游引物、Taq DNA聚合酶，其余为超纯水；具体引物序列为：
上游引物：5’-GTCGCCTCCGTACTGTATTTCTCC-3’，
下游引物：5’-GGGTCCATCTTAACATCTTCAGTG-3’；
所述酶切反应液包括10×Buffer和EcoRⅠ；
所述阳性对照为PCR扩增后已酶切鉴定过的斑点叉尾鮰D-loop标准样品；
所述阴性对照为PCR扩增后未酶切的斑点叉尾鮰D-loop标准样品。
2.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中，含有10×PCR Buffer2.5μl、MgCl22.0μl、dNTPs2.0μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.5μl，以及超纯水16μl。
3.根据权利要求1所述斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，其特征在于，所述酶切反应液中，含有10×Buffer2.0μl和EcoRⅠ1.0μl。
4.根据权利要求1至3任一项所述斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒，其特征在于，所述裂解液室温存放，所述抽取液Ⅰ和抽取液Ⅱ贮藏于4℃，PCR反应液、酶切反应液、阴性对照和阳性对照贮藏于-20℃。
5.一种如权利要求1所述斑点叉尾鮰物种鉴定试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，DNA提取：
1)取待检测样本0.08～0.12g，充分碾碎后，加入500μl裂解液，置于50～60℃水浴中孵育1h～2h，得到混合液；
2)向混合液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
3)向上清液中加入等体积抽提液Ⅰ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
4)向上清液中加入等体积抽提液Ⅱ，进行12000r/min离心10min，取上清液；
5)向上清液中加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，于-20℃沉淀1h，再进行12000r/min离心10min；
6)将离心后的溶液用体积分数为70％的乙醇清洗一次，再10000r/min离心5min，去掉上清液，得到沉淀；
7)将沉淀自然风干，加100μl无菌水溶解，得到DNA溶液，备用；
步骤二，PCR扩增：
1)于冰上解冻PCR反应液，使之完全溶解，将PCR反应液加入到PCR反应管中；
2)取步骤一得到的DNA溶液1μl，加入PCR反应管内，混合均匀；
3)将PCR反应管放入PCR仪，反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min，然后降温至12℃；
4)所得的PCR产物置于冰上即可使用，或置于-20℃备用；
步骤三，酶切鉴定：
(1)取步骤二得到PCR产物5μl，与酶切反应液混合，37℃温育2～3h，得到酶切产物；
(2)将上述酶切产物和阳性对照及阴性对照进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行鉴定，与阳性对照的电泳结果一致的待测样品即为斑点叉尾鮰。
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