CN106754879A - 一种植物叶片dna简化快速提取方法 - Google Patents

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许向阳
赵婷婷
姜景彬
张贺
陈秀玲
李景富
王傲雪
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明公开了一种植物叶片DNA简化快速提取方法，其步骤如下：一、将鲜嫩的植物叶片置于离心管中；二、取石英砂于装有叶片样本的离心管中，加入NaOH溶液，用灭过菌的1000μl移液器枪头直接进行研磨，磨至无明显叶块为止，盖好管盖并用封口膜封口，以防止沸水浴时管盖被蒸汽顶开；三、将研磨后封好的离心管置于沸水浴中；四、将离心管置于离心机中常温离心；五、吸取上清液，加入到新的离心管中，同时添加Tris‑cl缓冲液。本发明的方法对实验室条件要求非常低，所用仪器、试剂极其简单，且操作简便，效果好，适用于番茄、黄瓜叶片的快速提取，尤其适用于不同样品的大规模提取。

Description

一种植物叶片DNA简化快速提取方法
技术领域
本发明涉及一种植物叶片DNA提取方法。
背景技术
DNA提取是实验室最常见的分子操作之一，尤其是在植物育种的大规模分子标记鉴定工作中，往往需要提取成千上万份材料的DNA，采用传统的提取方法会存在效率偏低的问题；而先进的仪器提取需要购买试剂盒等配套耗材试剂，成本较高；普通的快速提取技术虽然大大简化了提取过程，但是对于前期的研磨过程基本依赖仪器，对实验室硬件条件提出了要求。
发明内容
本发明的目的是通过简化研磨条件，调整试剂配比，优化实验步骤，进而提供一种极其简易且高效的植物叶片DNA提取方法，该方法对实验室条件要求非常低，所用仪器、试剂极其简单，且操作简便，效果好，适用于番茄、黄瓜叶片的快速提取，尤其适用于不同样品的大规模提取。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种植物叶片DNA简化快速提取方法，包括如下步骤：
一、取样
将鲜嫩的植物叶片0.1～0.2g置于1.5mL离心管中。
二、研磨
取石英砂于装有叶片样本的离心管中，加入200～400μl、0.4MNaOH溶液，用灭过菌的1000μl移液器枪头直接进行研磨，磨至无明显叶块为止，盖好管盖并用封口膜封口，以防止沸水浴时管盖被蒸汽顶开。
三、沸水浴
将研磨后封好的离心管置于沸水浴中0.5～1.5min。
四、离心
将离心管置于离心机中常温离心。
五、获取DNA
吸取30～50μl上清液，加入到新的离心管中，同时按上清液与缓冲液体积比为1:9的比例添加0.1MTris-cl缓冲液(pH8.0)。
本发明具有如下优点：
1、所用药品简单。只有石英砂、NaOH和Tris-cl三种实验室常规药品，使用起来安全可靠。
2、所用仪器简单。只用到电磁炉(或其它加热设备)和普通离心机，一般实验室均可满足。
3、研磨过程优化。本方法中利用石英砂直接在碱液中研磨，既降低了研磨所需条件(如液氮研磨和研磨机研磨需要使用液氮或相应仪器设备)，又提高了DNA析出效率，一举两得。
4、操作简便。操作过程非常简单快捷，一个实验人员每小时可提取100个样品左右。
附图说明
图1为本发明与CTAB方法提取DNA的扩增结果。
具体实施方式
下面本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式提供了一种植物叶片DNA简化快速提取方法，具体操作步骤如下：
一、取样
鲜嫩的番茄或黄瓜叶片0.1～0.2g，直接置于1.5mL离心管中，标记好样品名称或编号。48小时内提取可于4℃保存，48小时以后提取置于-20℃保存，且不要反复冻融。
二、研磨
取适量石英砂(由于不同批次样品品质不同，可以预先研磨1～2个，以手感便于磨碎样品为准，用量不做严格要求，但要保证每个样品添加量基本一致，方便后续离心)于装有叶片样本的离心管中，加入300μl、0.4M NaOH溶液，用灭过菌的1000μl移液器枪头直接进行研磨，磨至无明显叶块为止，盖好管盖，并用封口膜在管盖和管口接触处缠绕两圈做安全封(防止水浴时管盖被蒸汽顶开)。试验过程中注意样品总重量配平。
三、沸水浴
事先用电磁炉等加热设备将水加热至沸腾，将研磨后封好的样品插在浮漂上，置于水面上水浴1min，及时捞起。
四、离心
将管壁的水擦干或晾干，置于离心机中在8000rpm的转速下常温离心3min，小心取出。
五、获取DNA
小心吸取50μl上清液，加入到新的离心管中，同时加入450μl、0.1MTris-cl缓冲液(pH8.0)，写好名称或编号(常规PCR20微升体系可取3微升作为模板)。
本实施方式的方法为微量提取技术，按照本实施方式方法提取的DNA样品电泳检测无条带，可采用常规PCR检测。
本实施方式中，药品成分及配比如下：
NaOH溶液：分析纯NaOH固体，ddH2O，终浓度为0.4M。
Tris-cl缓冲液：分析纯Tris-cl粉末，ddH2O，终浓度为0.1M。
具体实施方式二：本实施方式以番茄Ty-2基因的鉴定标记扩增为例，对比本发明与传统CTAB提取方法的实验效果。
CTAB法提取过程：
(1)用无菌枪头将液氮中速冻好的叶片研磨成粉末，磨好后迅速加入700μL在65℃水浴中预热的CTAB溶液，盖好盖子充分混匀。
(2)将混匀的样品置于65℃水浴1h，水浴过程中每隔几分钟将样品上下翻动，使其受热均匀，并使组织样本与溶液充分接触。
(3)水浴结束后，将样品取出在室温下冷却，冷却后加入700μL氯仿：异戊醇(24:1)混合液，混匀后静置10min。
(4)静置后的样品置于离心机中18℃下13000rpm离心10min，取上清液400mL，置于新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，充分混匀后室温下静置10min。
(5)静置后的样品置于离心机中18℃下13000rpm离心10min，取上清液400mL，置于新的EP管中，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，上下翻转EP管，轻轻混匀。于-20℃冰箱内静置20min。
(6)将静置后的样品取出，置于离心机中4℃下12000rpm离心10min，弃去上清液，用500μL的80％乙醇将沉淀洗涤2次，置于超净工作台中室温吹干。
(7)在EP管中加入300μL无菌水溶解DNA，溶解后加入4μL浓度为10mg/mL的RNaseA，37℃水浴1h。
(8)水浴后再加入300μL ddH2O，充分混匀后，加入600μL的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，充分混匀后静置10min。
(9)4℃下12000rpm离心10min，小心吸取上清液400mL，加入80μL在-20℃下预冷的NaAc，轻轻混匀，混匀后在-20℃下静置20min。
(10)4℃下12000rpm离心10min，弃去上清液。用200μL的80％乙醇将沉淀洗涤2～3次，洗涤后在超净工作台吹干。
(11)在干燥好的DNA沉淀中加入20～40μL无菌去离子水溶解DNA。
本发明提取过程：见具体实施方式一。
PCR体系及反应条件设置见表1和表2：
表1反应体系
表2反应程序
扩增在以上PCR体系及反应条件下进行，选择性扩增完成后，取5μl预扩增产物和1μl Loading Buffer混合后在0.8％琼脂糖胶中检测选择性扩增结果。
扩增结果见图1。扩增结果显示，按照本发明方法提取的DNA扩增效果与CTAB方法提取DNA的扩增效果基本一致，扩增条带清晰，亮度较高，符合检测用质量标准。

Claims (4)

1.一种植物叶片DNA简化快速提取方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、取样
将鲜嫩的植物叶片0.1～0.2g置于1.5mL离心管中；
二、研磨
取石英砂于装有叶片样本的离心管中，加入200～400μlNaOH溶液，用灭过菌的1000μl移液器枪头直接进行研磨，磨至无明显叶块为止，盖好管盖并用封口膜封口，以防止沸水浴时管盖被蒸汽顶开；
三、沸水浴
将研磨后封好的离心管置于沸水浴中0.5～1.5min；
四、离心
将离心管置于离心机中常温离心；
五、获取DNA
吸取30～50μl上清液，加入到新的离心管中，同时按上清液与缓冲液体积比为1:9的比例添加Tris-cl缓冲液0.1M。
2.根据权利要求1所述的植物叶片DNA简化快速提取方法，其特征在于所述植物叶片为番茄或黄瓜叶片。
3.根据权利要求1所述的植物叶片DNA简化快速提取方法，其特征在于所述NaOH溶液的浓度为0.4M。
4.根据权利要求1所述的植物叶片DNA简化快速提取方法，其特征在于所述Tris-cl缓冲液的浓度为0.1M，pH＝8.0。
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