CN103509871B - 药典三种秦艽药材的dna条形码鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法，药典三种秦艽药材分别为大叶秦艽Gentiana？macrophylla？Pall、粗茎秦艽G.crassicaulis？Duthie、和麻花秦艽G.straminea？Maxim。该鉴别方法包括DNA提取与对得到的DNA序列拼接两大步骤。其中DNA提取通过增加裂解加热的时间，并且用等体积的酚∶三氯甲烷(1∶1)去除酚及多糖类物质的干扰，得到了较好的提取效果。然后将所得到的DNA序列进行拼接后对秦艽进行鉴定，得到了较好的鉴别效果。

Description

药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法

技术领域

本发明涉及药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法。

背景技术

秦艽为传统常用中药，始载于《神农本草经》，列为“中品”，性平，味辛、苦，归胃、肝、胆经，根入药。传统中医认为其具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的功效。随着现代医药学科技在化学成分，药理药效，临床应用等研究中的迅速发展，秦艽的药理作用被进一步发现，临床应用也越来越广泛。药理研究和临床应用表明，秦艽不仅在抗炎镇痛方面具有明显的作用，还可以调节免疫，抗感冒病毒，抑制念珠菌生长，对心脑血管及肝脏也具有一定的保护作用，对面瘫等神经系统疾病效果也很显著。大叶秦艽Gentiana macrophyllaPall.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie.、和麻花秦艽G.straminea Maxim.这三种秦艽为中国药典收载品种。

DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNA Barcoding的概念由加拿大Paul Hebert首次提出。Paul Hebert等有关研究表明，可以用线粒体基因(COI)作为一个标准片段来分辨动物界中的近缘物种，线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(Cytochrome coxdase I，COI)是一个600bp的DNA序列。据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种，这如同超市用以区分成千上万种不同商品的条形码，因此把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码(DNAbarcodes)。DNA是生物的遗传信息的载体，遗传信息的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，这就给DNA条形码提供了物质基础，DNA每个位点上都有A、T、G、C4种选择，由于DNA序列中碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，所以目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。

PCR技术即无细胞分子克隆法：是指在微量离心管中，加入适量的缓冲液、模板DNA、四种脱氧单核苷酸、耐热性多聚酶以及一对合成DNA的引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段组成一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数增长一倍，一般样品经过30-40次循环，最终使基因放大数百万倍，最终得到扩增了百万倍的特异区段的DNA的方法。这种技术由Kary B.Mullis(穆利斯(美))创建。在此之前Khorana(1971)等曾提出DNA在体外变性后，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想；1983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得以实现；1988年Saiki等又将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术，使PCR变得更加便捷、高效和经济；1989年美国《Science》杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，曾有人比喻1989年为PCR的爆炸年，Mullis也因此荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术具有高度的灵敏性、特异性、操作简便易行的特点，可被用于基因克隆，基因检测，基因配型，基因鉴定等研究领域，从而逐渐而成为人类学研究、法医学检验、基因工程产品、基因治疗、基因诊断中的一种广泛性技术手段。PCR技术的兴起，无疑对DNA条形码鉴定带来了便利，利用了PCR技术可对需要的目的片段进行扩增，继而进行测序等后续实验。

目前，DNA条形码已经在动物中得到广泛应用，它不仅可以对动物物种进行鉴定分类，还可以扩充物种的DNA条形码信息，并且可以发现新种和隐存种。其在植物中的研究也正在快速开展，这项技术对于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定带来了便捷。除此之外，植物DNA条形码技术还可以用于辨别食草动物日常取食材料、监测植物根系的空间分布格局、发现隐形物种、以及研究入侵植物。但是各种DNA片段在不同类群中的应用效果不同，目前仍未获得统一的植物条形码标准片段，可以运用于各物种的鉴别。因此，当前的研究热点仍然是寻找一种可能的条形码片段，可以进行更大规模的分析和整体评价。许多学者对此进行了积极深入的探索，目前也得出了多种条形码片段或组合方法，但至今仍未达成明确的共识。Kress等通过对核基因ITS和9个质体基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)序列进行实验分析，提出了片段组合的方案，他认为ITS+trnH-psbA组合将在有花植物中得到广泛应用。在此之后Chase等提出rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-psbA片段组合；与此同时Ki-Joong Kim等提出matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnH-psbA片段组合；Kress和Erickson同时提出rbcL+trnH-psbA可以对陆生植物进行识别和鉴定。国际植物条形码工作组(The Consortium for the Barcode ofLife PlantWorking Group)推荐叶绿体基因matK和rbcL作为陆生植物的标准DNA条形码片段。

有关研究表明ITS(包含ITS2)序列和trnH-psbA序列对葫芦科植物种间鉴定的成功率高，rbcL也可用于种间鉴定，但成功率相对前两者较低。对于锦葵科植物的鉴别，ITS和psbA-trnH也是较适合的DNA条形码序列组合。谭丽盈等研究表明叶绿体基因rbcL序列可用于鉴别十大功劳及其伪品。秦民坚等亦用叶绿体rbcL基因对射干及类似药用植物基因序列进行了分析，结果表明叶绿体rbcL基因序列可以很好的鉴别5种鸢尾科植物。此法现今已经被用于中药秦艽的鉴别，张得钧等通过筛选表明ITS序列适合作秦艽基原植物的DNA分子鉴定，罗焜等已经将ITS2条形码直接用于药材秦艽的鉴别。而组合片段对中药秦艽的鉴别还未见报道，本研究即探索了适合用于秦艽药材的条形码组合片段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法，其中药典三种秦艽药材分别为大叶秦艽Gentiana macrophylla Pall.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie.、和麻花秦艽G.straminea Maxim.，包括以下步骤：

(1)取过60-80目筛的秦艽药材粉末加至离心管中，加入适量预热的Buffer PCB和β-巯基乙醇并混匀，65℃水浴加热35-45min，间或混匀；用等体积的酚∶三氯甲烷反复混匀，离心后取上清，反复操作2-3次；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至干净的离心管中，加入等体积Buffer BD，混匀，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用适量PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入干净的离心管中，加入60℃预热的TE Buffer，静置后离心，即得DNA溶液；

(2)将提取的DNA序列进行PCR扩增与测序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再将psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL拼接，得到两条拼接序列，分别计算遗传距离，并构建系统发育树。

本发明的有益效果是：

目前中药DNA条形码研究多是从原植物叶片中提取DNA，但是在实际运用中，我们通常面对的是药材，这无疑为中药材的鉴定工作带来了不便，局限了DNA用于中药鉴定的范围。本实验在按照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明书基础上提取秦艽样品时，叶类样品中的DNA易于提出，条带清晰，但是药材DNA显示模糊或无条带显示，这可能是由于根类药材不易裂解，并且根类药材中含有多糖、多酚或者一些此生代谢产物干扰了DNA的提取。针对这一问题，对有关提取步骤作出相应改变，秦艽药材DNA提取得到了较好的效果。

实验结果表明ITS、psbA-trnH和rbcL三种条形码单独用于秦艽的分子鉴定，均存在一些缺陷，rbcL序列过于保守，psbA-trnH序列种间和种内遗传距离有重叠，而ITS序列虽可用作秦艽分子鉴定，其种内遗传距离与种间遗传距离十分接近，难以确保鉴定的准确性。为此，分别将psbA-trnH和rbcL两条序列拼接，将ITS、psbA-trnH和rbcL三条序列拼接，用于秦艽的鉴别，这两组拼接序列构建系统发育树的结构一致。且ITS的变异位点只有10个，而psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL变异位点分别为34个和44个，因此认为，组合序列建立的系统发育树，能更准确的表现秦艽的亲缘关系。

附图说明

图1本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的部分样品的PCR产物检测结果(rbcL)。

图2是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的ITS序列系统树。

图3是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的psbA-trnH+rbcL序列系统树。

图4是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的ITS+psbA-trnH+rbcL序列系统树。

图5是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的和市场药材psbA-trnH+rbcL序列系统树。

图6是本发明药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法实施例的秦艽样品和市场药材ITS+psbA-trnH+rbcL序列系统树。

具体实施方式

1实验仪器与试药

1.1实验仪器

DDY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，T196 PCR扩增仪(德国Biometra)，GeCDOCXR凝胶成像系统(美国伯乐Bio-RAD)，HANGPINGJA3003N电子分析天平，KM-15200KUBOTA离心机，eppendorfCentrrfuge 5417R超速冷冻离心机(德国eppendorf)，国华HH-60数显恒温搅拌循环水箱，BCD-2181E冰箱(荣事达Royalstar)，Panasonic NM-S553MF微波炉(上海松下微波炉有限公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SAXXYO MDF-382E-80℃超低温冰箱(日本)，Aquapro艾科浦AYJ1-0501-U超纯水系统(颐洋企业发展有限公司)，LQP-B-4制冰机(六泉Anke)，PHOTOA干燥箱(上海一恒科技有限公司)，SK-1快速混匀器(国华)，TopPette手动单道可调式移液器(上海汉林实验仪器有限公司)；1.5mL，2.0mL离心管(生工生物工程(上海)有限公司)，PCR薄壁管及薄壁管盖(生工生物工程(上海)有限公司)，微量吸头(10μL，200μL，1000μL)(生工生物工程(上海)有限公司)。

1.2实验试剂

Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒，5×TBE，1×TE，DNAmarker-D，Green-DNADye核苷酸胶体染料，6×Clyerol DNA Loading Buffer缓冲液，琼脂糖(Agarose B.Low EEO)以上试剂均购于生工生物工程(上海)有限公司，Extaq酶(DRRooATaKaRa)，无水乙醇(AR国药集团化学试剂有限公司)，异丙醇(AR国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷(AR上海振企化学试剂品有限公司)，β-巯基乙醇(Reanta Scientific Technology Co.LTD)，PCR扩增引物合成(生工生物工程(上海)有限公司)。

1.3样品及来源

样品来源见表2，其中獐牙菜由全国第四次中药资源普查舒城调查队提供，样品为从标本上取得叶片，其余样品均为秦艽药材采自四川省松潘县。

表2样品来源

2实验方法

2.1总DNA提取

按照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作，取过60目秦艽药材粉末或叶片适量在液氮中充分研磨，并转移至1.5mL的离心管中，加入600μl 65℃预热的BufferPCB和12μlβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃水浴20～30min，药材类样品加热35～45min，间或混匀；加入等体积的三氯甲烷，充分混匀，12000rpm离心5min，药材类样品在此之前先用等体积的酚∶三氯甲烷(1∶1)反复混匀，12000rpm离心5min，取上清(不要吸到中间变性蛋白质的部分)，反复操作2次；吸取上层水相至一个干净的1.5mL的离心管中，加入等体积Buffer BD，颠倒混匀3-5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μl Wash Solution，10000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，晾干。取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μl 60℃预热的TEBuffer，静置3min，12000rpm离心2min，即得DNA溶液。将得到的DNA溶液置于0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上观察DNA的提取情况。

2.2PCR扩增与测序

将成功提取DNA的样品，分别采用通用引物“psbAF”(5’-GTTATGCATGAACGTAAGCTC-3’)和“trnHR”(5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’)扩增叶绿体DNApsbA-trnH序列，采用通用引物“rbcL-1f”(5’-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3’)和“rbcL-724r”(5-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3’)扩增叶绿体rbcL序列，采用通用引物“ITS5”(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和“ITS4”(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增核糖体DNA ITS序列。扩增反应在Bio-metrathermal cycler PCR扩增仪上进行。扩增体系和反应程序分别见表3和表4。

表3：扩增体系

表4：反应程序

PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，在成像系统拍照如图1。PCR扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行双链测序，psbA-trnH、rbcL和ITS的测序引物分别为“psbAF”和“trnHR”、“rbcL-1f”和“rbcL-724r”、“ITS1a”和“ITS4”。

2.3数据处理

psbA-trnH、rbcL和ITS序列的起止范围分别参照GenBank中大叶秦艽的登录号GQ435169和DQ398652，GQ436510，以及麻花秦艽的登录号GQ435168确定边界；所得DNA序列使用CExpress软件进行校对拼接，用BioEdit软件进行多序列比对。将得到所有序列利用MEGA 4.1(molecular evolutionary genetics analysis)软件分析。采用K-2-P(kimura2-parameter)模型，计算K-2-P种间和种内遗传距离，构建NJ系统树。

3结果分析

3.1序列特征

对22个样本DNA提取、PCR及双链测序成功率分别为ITS(77％)、psbA-trnH(82％)、rbcL(91％)。序列特征见表5，大叶秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽3个品种ITS、psbA-trnH、rbcL序列长度分别为624-628bp、315-398bp、702-703bp。其中psbA-trnH序列长度变异较大，共有85个碱基的插入和缺失变异。粗茎秦艽和其他三种秦艽的psbA-trnH序列间存在五处片段的插入和缺失变异，分别在123bp处7个碱基的插入，186bp处11个碱基的插入，196bp处29个碱基的插入，272bp碱基处26个碱基的插入和315bp处10个碱基的插入。

3.2种间与种内变异分析

利用MEGA4.1软件计算种间和种内的遗传距离。psbA-trnH的种间序列变异较大，有32个变异位点，种间遗传距离为(0.001-0.081)，但是其与种内(0-0.003)遗传距离有重叠区；ITS种间遗传距离(0.006-0.011)大于种内遗传距离(0-0.005)，此条形码虽可以用作秦艽的分子鉴定，但差异较小。rbcL序列各物种种内变异为0，种间距离也很小(0.001-0.003)，也不适合用作秦艽的分子鉴定，鉴于上述情况，本研究分别将叶绿体的psbA-trnH和rbcL序列拼接，将三个序列ITS、psbA-trnH和rbcL全部拼接在一起，计算遗传距离，psbA-trnH+rbcL的种间遗传距离(0.004-0.025)大于种内遗传距离(0-0.00DITS+psbA-trnH+rbcL的种间遗传距离(0.006-0.02)也大于种内遗传距离(0-0.001、0.002)，两者均可用于秦艽的分子鉴定，见表5。

表5：秦艽ITS、psbA-trnH和rbcL序列特征及核苷酸变异

3.3秦艽的NJ树鉴定

为了更直观的表示鉴定结果，本研究使用MEGA4.1软件以舒城县采集的龙胆科的獐牙菜(Swertia bimaculata(Sieb.et Zucc.)Hook.f.et)类群构建ITS、psbA-trnH+rbcL和ITS+psbA-trnH+rbcL的NJ树，见图2三种秦艽DNA条形码ITS序列系统树，图3三种秦艽DNA条形码psbA-trnH+rbcL序列系统树，图4三种秦艽DNA条形码ITS+psbA-trnH+rbcL序列系统树。图2中Swertia bimaculata(Sieb.et Zucc.)Hook.f.et单独聚为一支，所有Gentianae Macorphyllae Radix聚为一支，其中G.macrophylla Pall.和G.crassicaulis Duthie.聚为一支，支持率为62％，G.straminea Maxim.单独聚为一个小支，支持率为71％，G.macrophylla Pall.与G.crassicaulis又各自聚为一个小支。同ITS，psbA-trnH+rbcL的分子系统树也分成Swertia bimaculata(Sieb.et Zucc.)Hook.f.et和Gentianae Macorphyllae Radix两大支，但是G.crassicaulis Duthie.单独聚为一支，其他两种聚为一支，其中G.straminea Maxim.和G.macrophylla Pall.各单独聚为一个小支。ITS+psbA-trnH+rbcL与psbA-trnH+rbcL结果一致。

3.4市场秦艽药材的抽检

为验证本研究建立的条形码序列鉴定秦艽药材的方法可行，特从亳州药材市场购得秦艽药材，并随即抽取两个样本，经安徽中医学院刘守金教授初步形态鉴定为秦艽。按照同样方法进行处理。使用MEGA4.1软件以舒城县采集的龙胆科的獐牙菜(Swertiabimaculata(Sieb.et Zucc.)Hook.f.et)为外类群与其他秦艽样品共同构建psbA-trnH+rbcL、和ITS+psbA-trnH+rbcL的NJ树，见图5和图6，其结果与上述一致。从psbA-trnH+rbcL系统发育树我们可以看到Unknowl和Unknow2与G.crassicaulisDuthie.聚为一支，可以初步判定其为粗茎秦艽(G.crassicaulisDuthie.)，再用MEGA4.1软件计算遗传距离，其与G.crassicaulisDuthie.遗传距离为0，与其他种间遗传距离都大于0.022。从ITS+psbA-trnH+rbcL系统发育树可以得出Unknow1和Unknow2与G.crassicaulisDuthie.聚为一支，再用MEGA4.1软件计算遗传距离，其遗传距离与G.crassicaulisDuthie.最近(0.002-0.003)，与其他种间遗传距离都大于0.016。据此，可以判定两个样品均为粗茎秦艽。

4结论与讨论

4.1秦艽药材中DNA提取方法的改进

目前中药DNA条形码研究多是从原植物叶片中提取DNA，这无疑为中药材的鉴定工作带来了不便，局限了DNA用于中药鉴定的范围。本实验初次按照按照Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒说明书基本方法提取秦艽样品时，叶类样品中的DNA易于提出，条带清晰，但是大部分药材DNA显示模糊或无条带显示，这可能是由于根类药材不易裂解，并且根类药材中含有多糖、多酚或者一些此生代谢产物干扰了DNA的提取。在原有提取方法的基础上，本实施例将裂解加热的时间进行延长，由20-30min延长到35-45min，，并且用等体积的酚∶三氯甲烷(1∶1)去除酚及多糖类物质的干扰，得到了较好的提取效果。

4.2秦艽药材条形码的筛选

由上述实验结果分析我们可以得出，ITS、psbA-trnH和rbcL三种条形码单独用于秦艽的分子鉴定，均存在一些缺陷，rbcL序列过于保守，psbA-trnH序列种间和种内遗传距离有重叠，而ITS序列虽可用作秦艽分子鉴定，其种内遗传距离与种间遗传距离十分接近，难以确保鉴定的准确性。ITS系统发育树与叶绿体psbA-trnH与rbcL拼接序列和ITS、psbA-trnH和rbcL的拼接序列建树结果有所不同，ITS系统发育树中G.macrophylla Pall.和G.crassicaulisDuthie.聚为一支，支持率为62％，再与G.stramineaMaxim.聚为一大支。psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL系统发育树中G.crassicaulisDuthie.单独聚为一支，支持率均为99％，G.stramineaMaxim.和G.macrophylla Pall.聚为一支，支持率分别为97％和85％。从支持率来看，psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL支持率高于ITS，且ITS的变异位点只有10个，将而psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL变异位点分别为34个和44个，因此认为，组合序列建立的系统发育树，能更准确的表现秦艽的亲缘关系。因此我们选取拼接序列作为鉴别秦艽的DNA条形码。本实施例表明，组合条形码psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL对秦艽进行鉴定，更为准确。

4.3秦艽药材的鉴别

运用本实验方法对亳州市场购买的药材进行鉴定，我们得出，市场购买的两个秦艽样品均为粗茎秦艽，这也从一定程度上验证了组合条形码psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL对秦艽鉴定可行性。本实验结果表明，ITS序列虽然可以将不同品种秦艽进行亲缘关系远近的划分，但是由于变异位点的限制，结果并不准确；组合条形码将ITS2序列包括在内，拥有更多的变异位点和更准确的鉴定结果，因此建议，在有条件的情况下，使用组合条形码psbA-trnH+rbcL与ITS+psbA-trnH+rbcL对秦艽药材进行鉴定，会更加准确。DNA条形码技术不仅能用于市场品种混乱的多来源药材的鉴定与质量评价，还可以探讨原植物间的亲缘关系及系统发育。传统鉴定方法通常要求鉴定人员具有很高的专业知识和技术能力。而即使是物种鉴定方面的专家，也难以对药材进行准确鉴定到种，药材DNA提取方法的改进，以及DNA条形码独有的专属性，为药材的物种鉴定提供了可能性。随着DNA条形码技术的进一步发展，这项技术还有可能形成供企业使用的药材生产标准、质检部门的检验依据。目前已有一些企业研发出了便携式PCR仪，那么我们可以想象，随着科技的发展，该技术有着巨大的应用空间，如果有一天便携式快速物种鉴定设备面世，将给药材的快速鉴定工作带来巨大的便利。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (1)

1.药典三种秦艽药材的DNA条形码鉴别方法，所述药典三种秦艽药材分别为大叶秦艽Gentiana macrophylla Pall.、粗茎秦艽G.crassicaulis Duthie.、和麻花秦艽G.stramineaMaxim.；其特征在于包括以下步骤：

(1)取过60-80目筛的秦艽药材粉末加至离心管中，加入适量预热的Buffer PCB和β-巯基乙醇并混匀，65℃水浴加热35-45min，间或混匀；用等体积的酚：三氯甲烷反复混匀，离心后取上清，反复操作2-3次；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至干净的离心管中，加入等体积Buffer BD，混匀，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用适量PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入干净的离心管中，加入60℃预热的TE Buffer，静置后离心，即得DNA溶液；

(2)将提取的DNA序列进行PCR扩增与测序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再将psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL拼接，得到两条拼接序列，分别计算遗传距离，并构建系统发育树。