CN105018620B - 一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 - Google Patents
一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105018620B CN105018620B CN201510452455.1A CN201510452455A CN105018620B CN 105018620 B CN105018620 B CN 105018620B CN 201510452455 A CN201510452455 A CN 201510452455A CN 105018620 B CN105018620 B CN 105018620B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lavender
- medicinal material
- tingia
- narrow
- leaved
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 title claims abstract description 68
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 12
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 239000008236 heating water Substances 0.000 claims description 8
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 5
- PFIPZKASKUWLHH-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O PFIPZKASKUWLHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RJOOTDIYJNEGLP-UHFFFAOYSA-N [3-(ethoxycarbonylamino)phenyl] n-phenylcarbamate;[3-(methoxycarbonylamino)phenyl] n-(3-methylphenyl)carbamate Chemical compound CCOC(=O)NC1=CC=CC(OC(=O)NC=2C=CC=CC=2)=C1.COC(=O)NC1=CC=CC(OC(=O)NC=2C=C(C)C=CC=2)=C1 RJOOTDIYJNEGLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WTWBUQJHJGUZCY-UHFFFAOYSA-N cuminaldehyde Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C=O)C=C1 WTWBUQJHJGUZCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 241001529749 Lavandula Species 0.000 description 14
- 235000002997 Lavandula Nutrition 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 101150088250 matK gene Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 235000001242 French lavender Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000144081 Lavandula dentata Species 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- LFDGRWDETVOGDT-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrole;hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CNC=1 LFDGRWDETVOGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100301006 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) cbbL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 101000952631 Homo sapiens Protein cordon-bleu Proteins 0.000 description 1
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033557 Palpitations Diseases 0.000 description 1
- 102100037447 Protein cordon-bleu Human genes 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040007 Sense of oppression Diseases 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 101150004101 cbbL gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- -1 chloromethanes Alkane Chemical class 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 101150074945 rbcL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103066 rpoC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了属于分子生物学技术领域的一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法。按照如下步骤进行：提取薰衣草药材的基因组DNA，以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列，基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。本发明提供的薰衣草药材核糖体DNA的ITS2片段制备方法可有效解决薰衣草药材的品种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高。能够成功实现对狭叶薰衣草和齿叶薰衣草药材或粉末的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法。
背景技术
狭叶薰衣草Lavandula angustifolia Mill.和齿叶薰衣草Lavandula dentataL.均属唇形科Lamiaceae薰衣草属Lavandula半灌木或小灌木地上干燥部分。薰衣草为维吾尔医习用药材，维吾尔语名为“吾斯提库都斯”，具有消散寒气、补胃理脑、燥湿止痛之功效，用于治疗胸腹胀满、感冒咳喘、头晕头痛、心悸气短和关节骨痛等症状，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》。由于两者性状极为相似、资源的匮乏和地区用药习惯，药材市场上代用、误用现象屡屡发生，导致不同种的薰衣草药材在不同地区等同入药，严重影响并制约薰衣草药材的治疗效果。运用传统鉴别方法要求药材外形完整，无损伤且鉴别者具有一定的主观性，而且可操作性不强，极难把二者区分开。
目前，DNA条形码鉴定药材已经在动物药材中得到广泛应用，它不仅可以对动物物种进行鉴定分类，还可以扩充物种的DNA条形码信息，并且可以发现新种和隐存种。植物药材DNA条形码发展相对较为缓慢，越来越多的研究表明单靠某一个片段不太可能对所有的植物物种进行准确鉴定。2007年Chase等明确提出两套组合方案：rpoC1+rpoB+matK和rpoC1+matK+trnH-psbA。同年Kress和rickson(2007)又提出使用rbcL+trnH-psbA对陆生植物进行识别和鉴定。2007年9月在台北举行的第二届国际生物条形码大会上韩国植物学家Ki-Joong Kim等提出matK+atpF-atpH+psbK-psbI和matK+atpF-atpH+trnH-psbA两个组合。目前，虽然国际条形码协会COBL推荐rbcl和matK作为植物的DNA barcoding鉴定研究，但2009年11月在墨西哥举办的由50余个国家350余位代表参加的“第三届国际条形码大会”上，我国科学家提出ITS2序列的鉴定能力优于rbcl和matK组合，建议ITS2作为药用植物通用的条形码序列。
维吾尔药材在加工或者储存会使得其中的DNA降解，不利于鉴定工作的进行，DNA的部分降解甚至是大部分降解理论上不会对PCR的效果产生大的影响，但是狭叶薰衣草和齿叶薰衣草在长久储存DNA降解的同时，产生了许多滋生菌的代谢物，这些代谢物会影响提取DNA的纯度，并且钝化PCR过程中Taq DNA聚合酶的活性，从而造成PCR失败，无法完成检测。也会造成实验的假阳性率升高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法。
一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)提取薰衣草药材的基因组DNA；
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
所述薰衣草药材的基因组DNA的提取方法为：取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末加至离心管中，加入预热的Buffer和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
所述加入预热的Buffer和β-巯基乙醇过程中加入盐酸吡多胺和细胞裂解液。
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer 3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
本发明的有益效果：本发明提供的薰衣草药材核糖体DNA的ITS2片段制备方法可有效解决薰衣草药材的品种鉴定以及种质资源的开发利用等问题。本发明方法适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高。能够成功实现对狭叶薰衣草和齿叶薰衣草药材或粉末的快速、准确鉴定。本发明加入盐酸吡多胺和细胞裂解液，有利于DNA的提取，细胞裂解液可以将材料中的DNA分子尽量多的释放出来，便于提取，盐酸吡多胺保护DNA分子，使其免于被体内的活性酶降解，也能避免离心时对DNA的物理破坏。
附图说明
图1为实施例1样品PCR结果图；
图2为实施例2样品PCR结果图；
图3为实施例3样品PCR结果图；
图4为实施例4样品PCR结果图；
图5为实施例4ITS2序列的NJ树图；
图6为实施例5样品PCR结果图；
图7为实施例5ITS2序列的NJ树图；
图8为实施例6样品PCR结果图；
图9为实施例6ITS2序列的NJ树图；
图中，M为1kb marker，1-6为各实施例样品PCR标号。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实验所采用的实验仪器：
DDY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，Bio-Rad PCR仪C1000，GeCDOCXR凝胶成像系统(美国伯乐Bio-RAD)，BS110S型电子天平(Sartorius)，Eppendorf Centrrfuge5417R超速冷冻离心机(德国eppendorf)，密理博Millipore纯水机/超纯水机(Millipore有限公司)，Eppendorf手动单道可调式移液器(Eppendorf有限公司)；1.5mL离心管(生工生物工程(上海)有限公司)，PCR薄壁管及薄壁管盖(生工生物工程(上海)有限公司)，微量吸头(10μL，200μL，1000μL)(生工生物工程(上海)有限公司)
实验试剂：
天根植物基因组DNA提取试剂盒，5×TBE，1×TE，DNAmarker-D，Green-DNADye核苷酸胶体染料，6×Clyerol DNA Loading Buffer缓冲液，琼脂糖(AgaroseB.LowEEO)以上试剂均购于生工生物工程(上海)有限公司，Extaq酶(天根生化科技(北京)有限公司)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)，PCR扩增引物合成(北京六合华大有限公司)。
样品来源：狭叶薰衣草Lavandula angustifolia Mill.来源于乌鲁木齐维吾尔医院，储存时间分别为新鲜，1年，3年；齿叶薰衣草Lavandula dentata L.来源于和田维吾尔药材市场(进口)储存时间分别为新鲜，1年，3年。
实施例1
选取新鲜的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR扩增出目的条带，但扩充量较小，不容易辨识，增加循环数后仍然扩充量较小(如图1所示)。
实施例2
选取储存1年的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR不能扩增出目的条带，增加循环数后扩增量较小，不容易辨识扩增条带(如图2所示)。
实施例3
选取储存3年的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR不能扩增出目的条带，增加循环数后仍然不能扩增出目的条带(如图3所示)。
实施例4
选取储存3年的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer、加入(10uL)盐酸吡多胺和(10uL)细胞裂解液和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR扩增出目的条带，扩增量充足，容易辨识，构建出ITS2序列的NJ树并鉴别出狭叶薰衣草和齿叶薰衣草(如图4-5所示)。
实施例5
选取储存3年的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer、研磨过程中，加入枯茗醛(10uL)和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR扩增出目的条带，扩增量充足，容易辨识(如图6-7所示)。
实施例6
选取储存3年的薰衣草药材(含有取自3株狭叶薰衣草和3株齿叶薰衣草中叶片或花穗)，鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，按照如下步骤进行：
(1)取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末(30mg)加至离心管中，加入(700uL)预热的Buffer、加入槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(10ug)和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液。
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述PCR扩增体系为：PCR Buffer3μL，2.5mmol/L的Mg2+ 3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树。
检测结果：PCR扩增出目的条带，扩增量充足，容易辨识(如图8-9所示)。
Claims (3)
1.一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)提取薰衣草药材的基因组DNA；
(2)以ITS2F引物和ITS3R为引物，PCR扩增目的片段ITS2序列；所述ITS2F引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述ITS3R引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
(3)基于K2P模型，构建待测样品的ITS2序列的NJ树；
所述薰衣草药材的基因组DNA的提取方法为：取薰衣草药材中叶片或花穗，用无水酒精漂洗、晾干，放置研钵中加液氮冷冻，磨碎至粉末，取粉末加至离心管中，加入预热的Buffer和β-巯基乙醇并混匀，60-70℃水浴加热35-45min，中间颠倒混匀，10min/次，1-5次；用等体积的酚：三氯甲烷混匀，离心后取上清；加入等体积的三氯甲烷，混匀后离心，吸取上层水相至一个干净的离心管中，再加等体积的无水乙醇，混匀后全部加入到吸附柱中，静置2-5min；离心，再分别用PW Solution和Wash Solution离心，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，加入TE，静置一段时间后离心，即得DNA溶液；
所述加入预热的Buffer和β-巯基乙醇过程中加入盐酸吡多胺和细胞裂解液；
所述研磨过程中，加入枯茗醛。
2.根据权利要求1所述一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：PCR Buffer 3μL，2.5mmol/L的Mg2+3μL，2.5mmol/L的dNTPs混合物3μL，2.5μmol/L的上下游引物各1.0μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL。
3.根据权利要求1所述一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法，其特征在于，所述PCR的反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s；40个循环，72℃延伸10min，40个循环。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510452455.1A CN105018620B (zh) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510452455.1A CN105018620B (zh) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105018620A CN105018620A (zh) | 2015-11-04 |
| CN105018620B true CN105018620B (zh) | 2018-02-09 |
Family
ID=54408918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510452455.1A Active CN105018620B (zh) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | 一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105018620B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509871A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-15 | 安徽中医药大学 | 药典三种秦艽药材的dna条形码鉴别方法 |
-
2015
- 2015-07-28 CN CN201510452455.1A patent/CN105018620B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103509871A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-15 | 安徽中医药大学 | 药典三种秦艽药材的dna条形码鉴别方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105018620A (zh) | 2015-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hou et al. | Stability and accuracy assessment of identification of traditional Chinese materia medica using DNA barcoding: a case study on Flos Lonicerae Japonicae | |
| CN103468709B (zh) | 霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法 | |
| CN104450905B (zh) | 一种凉粉草与溪黄草的dna鉴定方法 | |
| CN104498599B (zh) | 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒 | |
| Naim et al. | Molecular identification of herbal species belonging to genus Piper within family Piperaceae from northern Peninsular Malaysia | |
| CN104342495B (zh) | 鉴别分枝虫草的特征性核苷酸序列、核酸分子探针、试剂盒和方法 | |
| CN105018620B (zh) | 一种鉴别狭叶薰衣草和齿叶薰衣草的方法 | |
| CN105274245B (zh) | 一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对 | |
| Xu et al. | Authentication of official Da-huang by sequencing and multiplex allele-specific PCR of a short maturase K gene | |
| AU2015100441A4 (en) | Method for Molecular Authentication of Panax ginseng and Panax quinquefolius Using SNP Markers in Dammarenediol Synthase (DS) Gene | |
| Ryuk et al. | Monitoring and identification of Cynanchum wilfordii and Cynanchum auriculatum by using molecular markers and real-time polymerase chain reaction | |
| CN106434645A (zh) | 一种降香黄檀的its区序列及用其鉴定降香黄檀的方法 | |
| CN102140521B (zh) | 一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法 | |
| CN107619879A (zh) | 一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的引物对及其应用 | |
| Xiong et al. | Identification of Andrographis Herba and its common products using mini-barcode | |
| CN104894121A (zh) | 一种用于鉴定前胡的引物对及其应用 | |
| Nabavi et al. | Population genetic study of Ziziphus jujuba Mill.: insight in to wild and cultivated plants genetic structure | |
| Bao-Zhong et al. | Survey of traditional Dai medicine reveals species confusion and potential safety concerns: a case study on Radix Clerodendri Japonicum | |
| CN104830971A (zh) | 一种西洋参分子身份证及鉴定方法 | |
| CN102181538B (zh) | 辅助鉴定锁阳属植物的方法及其专用引物 | |
| CN104818337A (zh) | 采用特异性引物鉴别汾远2号远志的方法 | |
| CN105506159A (zh) | 一种用特异性pcr引物检测花椒的方法 | |
| Umer et al. | The molecular identification of Zanthoxylum armatum DC of Pakistan based on DNA barcoding | |
| CN106399474A (zh) | 一种铁皮石斛干药材分子鉴定方法及其应用 | |
| CN104894270A (zh) | 一种用于鉴定紫花前胡的引物对及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240326 Address after: Room 1701-167, Tianhe Plaza, No. 320 Tianjin North Road, High tech Zone (New City District), Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region, 830011 Patentee after: Xinjiang elexin Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No. 140, Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi, Xinjiang Uygur Autonomous Region Patentee before: XINJIANG INSTITUTE OF MATERIA MEDICA Country or region before: China |