CN104073560B

CN104073560B - 一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法

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Publication number: CN104073560B
Application number: CN201410304972.XA
Authority: CN
Inventors: 周涛; 赵丹; 江维克
Original assignee: Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guizhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104073560A

Abstract

本发明公开了一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括：利用由序列表中序列1设计合成序列表中序列2和序列3所示的引物，以序列2和序列3对鉴别样品的基因组DNA进行一次PCR反应；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：PCR反应产物经凝胶电泳后凝胶成像系统紫外观察，在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，未出现条带则为非杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入2μL？100×SYBR？Green？I核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察，产生绿色荧光则为杜仲药材或原植物，否则为非杜仲药材或原植物。本发明可快速、准确的鉴别出杜仲药材或原植物，操作简捷、实用性好。

Description

一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种中药材或原植物的真伪鉴别方法，尤其是一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法。

背景技术

杜仲EucommiaulmoidesOliv.为中国特有树种，早在一千年前已为民间栽培入药使用，具有补肝肾、强筋骨的作用，现代临床用于治疗高血压病，疗效良好。另外，杜仲的树干、枝、叶、果中含有大量橡胶，也是一种优良的经济树木。

杜仲的种质资源遗传多样性比较丰富，不同产地或生境的杜仲原植物，其叶、芽、花、果等方面会表现出不同的特点，树皮也存在多个变异类型，如深纵裂型、浅纵裂型、龟裂型和光皮型，这就导致以树皮入药的杜仲药材易于产生掺假现象，如以断面有白色橡胶丝的红杜仲藤Urceolaquintaretii(Pierre)D.J.Middleton、紫花络石TrachelospermumaxillareHook.f.、白杜EuonymusmaackiiRupr.等植物的茎皮混充杜仲药材销售，而这些植物树皮在药理、药效及临床应用上与杜仲药材有很大的差别，有的甚至会产生毒副作用。

目前，杜仲研究大都以树皮、叶片等形态差异和解剖学特征为基础进行鉴别，有时也结合理化分析来鉴别，但是这种鉴别方法不仅费时费力，而且鉴别的准确性也较差。另外，虽然也有关于使用DNA分子测序技术分析rDNA-ITS2、matK片段的核酸序列来鉴定杜仲原植物真伪的报道，但是该方法操作复杂、成本高、耗时费力，且适用性差，不能大范围推广应用，也不能满足大规模样品鉴定的需求。

发明内容

本发明的目的之一是提供可快速、准确的鉴别杜仲药材或原植物的一段特异性DNA片段及一组引物；

本发明的另外一个目的是提供一种杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：杜仲药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列1所示。

杜仲药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列1所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。

前述的引物在杜仲药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。

包括前述引物的试剂盒。

杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，包括以下步骤：利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下两种方法之一进行鉴别：将PCR反应产物加入含溴化乙锭(即EB)的琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物；或者在PCR反应产物中加入SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物。

本发明中所述的对鉴别样品进行PCR反应包括：提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。

具体的说，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤：取鉴别样品2～5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。

前述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5～11μL，上游和下游引物(所述的上游引物即引物序列表中序列2所示的引物，下游引物即引物序列表中序列3所示的引物)各为5～40pmol，DNA模板50～200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～96℃预变性30～300s，94～96℃变性2～30s，45～65℃退火2～30s，71～73℃延伸2～45s，变性、退火、延伸一共进行27～39次循环；最后71～73℃后延伸18～300s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取4～7μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，65～100V稳压电泳35～50min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入1～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在300～400nm紫外光下观察。

优选的，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5～9μL，上游和下游引物各为10～20pmol，DNA模板50～150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～95℃预变性30～120s，94～95℃变性2～10s，60～65℃退火2～15s，72～73℃延伸2～15s，变性、退火、延伸一共进行29～33次循环；最后72～73℃后延伸20～60s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取5～6μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1％～1.3％琼脂糖凝胶中，70～85V稳压电泳35～45min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在340～380nm紫外光下观察。

更优选的，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7.5μL，上游和下游引物各为10pmol，DNA模板80～120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95℃预变性45s，95℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72℃后延伸30s；PCR反应产物的检测，采用以下两种方法之一进行：取5μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，在紫外凝胶成像系统下观察；或者在PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察。

发明人进行了一系列实验，以选择本发明提供的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法的鉴别条件等，证明本发明鉴别方法的有效性。具体如下：

一、序列的获取与比对

在NCBI(美国国立生物技术信息中心，NationalCenterforBiotechnologyInformation)下载到杜仲EucommiaulmoidesOliver、大果卫矛EuonymusmyrianthusHemsl.、冬青卫矛E.japonicusThunb.、粗糠树EhretiamacrophyllaWall.、毛杜仲藤ParabariumhuaitingiiChun&Tsiang、栀子皮ItoaorientalisHemsl.、紫花络石TrachelospermumaxillareHook.f.等植物的物种rDNA-ITS片段，共计34条序列，登录号分别为AY650004.1、AY650000.1、AY649994.1、AY649995.1、AY649998.1、AY649996.1、AY650005.1、AY649992.1、AY649993.1、AY650006.1、AY649997.1、AY650001.1、JF976307.1、JF976306.1、JF755926.1、KC999842.1、KC904097.1、JF755927.1、KC999832.1、HQ393721.1、KC999837.1、KC999834.1、KC999835.1、KC999830.1、KC999837.1、KC999836.1、KC999836.1、KC999839.1、KC999839.1、KC999840.1、KC999831.1、KC999838.1、KC999841.1、KC999833.1。发明人运用ClustalX2.1软件对这些序列进行排序、比对、分析后发现：rDNA-ITS序列能较好地反映出杜仲及其混伪品之间的种间差异，基于该差异，发明人进一步比对分析获得了具有稳定差异的杜仲特异性DNA片段，其序列如序列表中序列1所示。

二、引物的设计与筛选

发明人使用PremierPrimer5.0软件对上述杜仲特异性DNA片段进行引物设计，调整参数使上游引物在杜仲的特异性片段内，长度为100～500bp，共设计了3组引物，分别命名为duzhong-1F/duzhong-1R、duzhong-2F/duzhong-2R、duzhong-3F/duzhong-3R，各引物序列见表1。由上海生工生物科技有限公司及北京博迈德生物有限公司合成。

根据引物序列duzhong-1F/duzhong-1R、duzhong-2F/duzhong-2R、duzhong-3F/duzhong-3R的Tm值(DNA熔解温度)及扩增产物的长度，预先设置了特异性PCR扩增体系与扩增程序验证此3组引物的特异性。其体系及扩增程序见表1。取5μLPCR扩增产物加入含EB的1.2％琼脂糖凝胶中，80～85V稳定电压电泳50min，紫外凝胶成像系统观察，拍照保存。

表1引物及PCR反应条件

结果显示：3对杜仲鉴定引物中，duzhong-3F/duzhong-3R(即引物序列表中序列2和序列表中序列3)的PCR扩增特异性较另外2组引物要好，故本发明选择该组引物作为杜仲药材或原植物与伪品药材的分子鉴定引物，以之为基础进行下述扩增反应条件的优化。

三、杜仲药材或原植物的快速分子鉴别条件考察

(1)待测样品基因组DNA的提取与检测

①取待检样品2～5mg，采用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA；

②取4μL上述①所得DNA与1μL溴酚蓝-甲苯氰混匀后加入含EB的0.8％琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min，结果显示：所有的DNA模板均电泳出目的条带，表明上述①所得基因组DNA完整；使用核酸定量仪测定①所得基因组DNA的纯度，结果显示基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀≈1.8，表明该基因组DNA的质量满足于后续研究，可作为PCR反应的模板DNA。将DNA浓度调整为60～100ng/μL，-20℃保存备用。

图1为基因组DNA提取电泳图，其中λ为λDNA，1～5：杜仲，6～8：紫花络石，9～10：白杜，11～12：大果卫矛，13～14：大叶黄杨。

图1表明基因组DNA完整，调整浓度后可用于后续研究。

(2)PCR扩增反应条件优化及检测

以上述(1)所得基因组DNA为模板，根据序列表中序列2和序列3的Tm值及其扩增产物的长度设置PCR扩增条件，其具体操作步骤如下：

①运用特异性引物序列表中序列2和序列表中序列3，扩增反应采用25μL体系，其组分为：Taq酶预混液10μL，20pmol引物序列表中序列2，20pmol引物序列表中序列3，60ngDNA模板，灭菌重蒸水加至25μL。

②扩增程序：95℃预变性2min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸一共循环35次，72℃后延伸7min。

③扩增产物的检测：

ⅰ电泳检测：取5μLPCR扩增产物加入含EB的1.2％琼脂糖凝胶中，65V稳定电压电泳60min，紫外凝胶成像系统观察。

ⅱ荧光检测：扩增产物加入3μL100×SRYBGreenI混匀后紫外光下观察。

④扩增程序的优化

i退火温度：根据上述①、②、③，考察了45℃、50℃、55℃、60℃、65℃退火温度。结果显示，杜仲样品在退火温度为45～65℃的条件下均能扩增出目的条带，条带亮度随着退火温度的升高增强，而后又变弱，而混伪品均未检测出；荧光检测时在60～65℃时绿色荧光的亮度强且差异不明显；再考察60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃的退火温度，结果显示绿色荧光的亮度差异仍不明显。兼顾特异性与节约能源，本发明优选退火温度为62℃。

图2、图3分别为部分退火温度的电泳检测图及相应的荧光检测图，其中M为Marker，1～5(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为45℃退火，6～9(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨)为50℃退火，10～14(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为55℃退火，15～19(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为60℃退火，20～24(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为65℃退火。

ii变性时间：基于上述退火温度，考察了变性时间2s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，结果显示，在变性时间为2～30s内，杜仲样品均可电泳出目的条带；当变性时间为2～10s时，目的条带更加明亮清晰，尤其是当变性时间为5s时，目的条带最明亮清晰，荧光反应结果与电泳结果一致。因此本发明优选变性时间为5s。

iii退火时间：基于上述退火温度及变性时间的特征，考察了退火时间2s、5s、10s、15s、20s、25s、30s。结果显示：电泳检测显示退火时间为2～30s时，杜仲样品均能有效扩增，荧光检测结果与电泳结果一致，即杜仲均有绿色荧光；但是退火时间为2s时，电泳条带稍暗，为了保证PCR扩增产物的产量，本发明选择PCR退火时间为5s。图4、图5所示，分别为退火时间优化的电泳检测及相应的荧光检测图(M为Marker，1～6：2s、5s、10s、15s、20s、25s、30s)。

iv变性、退火、延伸的循环次数：根据上述④中的ⅰ～ⅲ，考察了27、30、33、36、39次变性、退火、延伸的循环次数，结果显示杜仲样品各个循环次数项下均能电泳出目的条带，条带的亮度随着循环次数的增加而增强，在39次循环时，大果卫矛样品在同一位置处稍有弥散；荧光检测结果与电泳结果一致。兼顾扩增反应的特异性与节约时间，本发明优选循环次数为30次；图6、图7分别为变性、退火、延伸的循环次数优化的电泳检测及相应的荧光检测图。其中，M为Marker，1～5(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为27次循环，6～10(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为30个次循环，11～15(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为33次循环，16～20(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为36次循环，21～25(杜仲、大果卫矛、紫花络石、白杜、大叶黄杨)为39次循环。

v基于上述④中的ⅰ～ⅳ，杜仲药材或原植物的快速分子鉴别的扩增程序最终优选为：

⑤PCR扩增体系组成的优化

根据上述④确定的扩增程序，对PCR扩增体系的组成进行以下优化：

iTaq酶预混液用量：在扩增体系(25μL)中Taq酶预混液用量分别为3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL。结果显示Taq酶预混液用量为5～9μL时可电泳出目的条带，其亮度随着Taq酶预混液用量的增加先增强后减弱，荧光检测显示Taq酶预混液用量为5～11μL时杜仲样品均可产生绿色荧光，亮度随着Taq酶预混液用量的增加先增强后减弱。在此条件下，考察了5.5μL、6μL、6.5μL、7μL、7.5μL、8μL、8.5μL、9μL、9.5μL、10μL、10.5μL、11μL的Taq酶预混液用量，结果显示为当Taq酶预混液用量为6.5～9μL时，目的条带明亮清晰，尤其是当用量为7.5时，目的条带的显示效果最好，因此本发明优选PCR反应体系中Taq酶预混液的用量为7.5μL。

图8、图9分别为部分Taq酶预混液用量优化的电泳检测及相应的荧光检测图，其中M为Marker，1～5(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为5μLTaq酶预混液用量，6～10(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为7μLTaq酶预混液用量，11～15(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为9μLTaq酶预混液用量，16～20(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为11μLTaq酶预混液用量，21～24为(杜仲、紫花络石、大果卫矛、白杜)13μLTaq酶预混液用量。

ii引物用量：根据上述⑤中的ⅰ，考察在25μL扩增体系中引物序列表中序列2、序列表中序列3的用量均为5pmol、10pmol、20pmol、30pmol、40pmol。图10、图11显示：序列表中序列2和序列表中序列3用量为5～40pmol时，杜仲样品均可有效扩增，荧光检测时杜仲样品的扩增产物均能产生绿色荧光，尤其是当引物用量为10～20pmol时，效果更好；引物用量为10pmol最节约引物，因此，本发明优选引物用量为10pmol。

图10和图11分别为引物用量优化的电泳检测及相应的荧光检测图，其中，M为Marker，CK为空白对照，1～2(杜仲、白杜)为5pmol的引物用量，3～4(杜仲、白杜)为10pmol的引物用量，5～6(杜仲、白杜)为15pmol的引物用量，7～8(杜仲、白杜)为20pmol的引物用量，9～10(杜仲、白杜)为30pmol的引物用量。

iii模板DNA用量：在上述⑤中ⅰ、ⅱ的基础上，分别对25ng、50ng、100ng、200ng、400ng模板DNA的用量进行考察。结果显示：模板DNA用量在50～200ng时，荧光检测杜仲样品均能见绿色荧光，DNA模板用量均能扩增出明亮清晰的目的条带；当模板DNA用量在50～150ng时，效果更好，兼顾模板DNA用量及扩增效果的选择性，本发明优选模板DNA用量为80ng～120ng。

iv根据上述⑤中的ⅰ～ⅲ，杜仲药材或原植物的快速分子鉴别，运用特异性引物序列表中序列2和序列表中序列3，扩增反应采用25μL体系，其组分含量优选值为：

⑥结果检测条件的优化

根据上述④、⑤确定的扩增程序与扩增体系，对PCR扩增结果检测的条件进行以下优化：

i电泳检测：取5μLPCR扩增产物加入含EB的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，分别于65、70、80、90、100V稳定电压电泳，紫外凝胶成像系统观察。结果显示：在65～100V时均能电泳出目的条带，100V条带略有弥散；当在70～85V稳定电压电泳35～45min时，目的条带更明亮清晰，尤其是当在80V稳定电压电泳40min时即可获得又好又快的电泳效果，因此，本发明优选80V电泳40min检测PCR扩增产物。

ii荧光检测：在扩增产物中加入1、2、3μL的100×SRYBGreenI，紫外光下肉眼观察。结果显示：1～3μL的100×SRYBGreenI均能与杜仲样品的扩增产物产生绿色荧光，但1μL时，荧光稍暗。为节约核酸染料，本发明优选100×SRYBGreenI的用量为2μL。

iii基于上述⑥中的ⅰ、ⅱ，进行扩增结果检测时：取5μLPCR扩增产物加入含EB的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，80V稳定电压电泳40min，在400bp处出现条带，则为杜仲药材或原植物，400bp处无条带出现，则为其他材料；或者在扩增产物中加入2μL100×SRYBGreenI，在紫外光下肉眼观察是否有绿色荧光产生，产生绿色荧光，则为杜仲药材或原植物，未产生绿色荧光，则为其他材料。

四、重现性考察：

根据上述三中优选出的扩增条件，对其确定的方法进行重现性考察，具体操作如下：

i分别使用Mastercycler(德国Eppendof)、AppliedBiosystemsVeriti^TM96(美国ABI)、GeneAmpPCRsystem9700(美国ABI)三台不同厂家和型号的PCR仪，考察仪器对PCR反应稳定性的影响；

ii运用2×PowerTaqPCRMasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)、2×TaqPCRMasterMix(北京天根生化科技有限公司)、2×EasyTaqPCRSuperMix(北京全式金生物技术有限公司)、TaqPCRMasterMix(BioBasicInc.)四种Taq酶预混液进行扩增，考察不同厂家Taq酶预混液对PCR反应重现性的影响；

iii使用分别由上海生工生物科技有限公司、北京博迈德生物有限公司合成的2个批次的引物，考察不同厂家合成引物对PCR反应重现性的影响；

iv采用上述ⅰ、ⅱ、ⅲ中的条件进行试验，结果显示：采用三台不同厂家型号的PCR仪及不同厂家的Taq酶预混液进行扩增，均能有效扩增出目的片段，而不同批次的引物对PCR扩增结果也无明显差异。因此，本发明的杜仲药材或原植物的鉴别方法重现性较好，可用于杜仲药材或原植物的快速分子鉴定。图12、图13分别为不同厂家的Taq酶预混液扩增的电泳检测及相应的荧光检测图，其中M为Marker，1～5(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为2×PowerTaqPCRMasterMix扩增，6～10(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为2×TaqPCRMasterMix扩增，11～15(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为2×EasyTaqPCRSuperMix扩增，16～20(杜仲、紫花络石、白杜、大叶黄杨、大果卫矛)为TaqPCRMasterMix扩增。

五、方法有效性考察

为了验证本发明的快速分子鉴别方法可有效鉴别出杜仲药材或原植物，发明人还进行了一系列的试验研究，具体如下：

实验例1

(1)材料、试剂与仪器

a)材料

杜仲皮、杜仲叶药材128份，其中枝叶、茎皮是到产地原植物上采集，树皮与叶片是在市场上收购而得。另收集到杜仲易混品75份，其中枝叶、茎皮是到产地原植物上采集，树皮是在市场上收购而得。样品的来源信息见表2。所有药材样品均经专家鉴定。

表2样品来源表

b)试剂

琼脂糖(西班牙Biowestagarose)、D2000(北京索莱宝科技有限公司)、10000×SYBRGreenI核酸染料(北京索莱宝科技有限公司)、2×PowerTaqPCRMasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)、EB(北京天根生化科技有限公司)、2×TaqPCRMasterMix(北京天根生化科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

c)仪器

PCR仪(Mastercycler，德国Eppendof)、核酸定量分析仪(NANODROP2000，美国Thermo)、凝胶成像系统(GGM/D2，英国SYNGENE)、电脑三恒多用电泳仪(DYY-12，北京六一仪器厂)、自动蒸汽灭菌锅(ES-315，日本Tomy)、低温高速冷冻离心机(Centrifuge5810R，德国Eppendof)、单道可调移液管(4910，德国Eppendorf)、三用紫外仪(ZF-2，上海市安亭电子仪器厂)。

(2)基因组DNA提取与检测：取待检样品2mg，采用CTAB提取法提取各药材样品总基因组DNA，使用核酸定量仪测定基因组DNA的纯度与浓度，结果显示该模板DNA的质量满足于后续研究。将DNA浓度调整为60～100ng/μL，保存于-20℃冰箱。

(3)特异性PCR扩增：

运用如序列表中序列2和序列3所示的特异性引物，扩增反应采用25μL体系，其组分为：

扩增程序：

(4)结果的检测：

采用以下两种方法之一进行：取4～7μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，65～100V稳压电泳35～50min后，在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物，而其他非杜仲样品则没有条带出现；或者在PCR反应产物中加入1～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在300～400nm紫外光下观察，杜仲药材或原植物的PCR反应产物产生绿色荧光，而其他非杜仲样品则没有绿色荧光出现。

实验例2

(1)材料、试剂与仪器

同实验例1；

(2)基因组DNA提取与检测

同实验例1；

(3)特异性PCR扩增：

扩增程序：

(4)结果的检测：

采用以下两种方法之一进行：取5～6μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1％～1.3％琼脂糖凝胶中，70～85V稳压电泳35～45min后，在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物，而其他非杜仲样品则没有条带出现；或者在PCR反应产物中加入2～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在340～380nm紫外光下观察，杜仲药材或原植物的PCR反应产物产生绿色荧光，而其他非杜仲样品则没有绿色荧光出现。

实验例3

(1)材料、试剂与仪器

同实验例1；

(2)基因组DNA提取与检测

同实验例1；

(3)特异性PCR扩增：

扩增程序：

(4)结果的检测：

取5～6μLPCR扩增产物加入含EB(溴化乙锭)的1.2％琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，紫外凝胶成像系统下观察，杜仲药材或原植物在400bp处出现条带，而其他非杜仲样品在400bp处没有条带出现；或者在PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察，杜仲药材或原植物呈现绿色荧光，而其他非杜仲样品则没有产生绿色荧光。

以上验证试验的部分结果如图15、图16所示(其中，M为Marker，CK为空白对照，1～5：dz-01、dz-03、dz-06、dz-10、dz-15，6～9：bd-01、bd-02、bd-03、bd-04，10～13：dgwm-01、dgwm-02、dgwm-03、dgwm-04，14～17：zhls-01、zhls-03、zhls-04、zhls-05，18～21：dyhy-01、dyhy-02、dyhy-03、dyhy-04)，通过图15、图16可知，电泳检测时仅杜仲样品在400bp处出现条带，其他样品未出现条带；荧光检测时仅杜仲样品呈现绿色荧光，其他样品则未出现绿色荧光。电泳检测与荧光检测结果一致，相互印证了本发明鉴定杜仲药材或原植物真假的方法是准确、可靠的。

另外，通过对比实验例1～实验例3的检测结果发现：实验例1～实验例3检测时显示的绿色荧光及400bp处出现的条带均比较明显；尤其是采用实验例3中的条件进行检测时，特异性PCR扩增耗费时间最短(实验例1花费的时间约为80min，实验例2花费的时间约为50min，实验例3花费的时间约为35min)，所耗实验试剂最少，成本最低。

与现有技术相比，本发明可根据杜仲药材或原植物的特异性DNA片段(其序列如序列表中序列1所示)设计得到的一组引物(其序列如序列表中序列2和序列3所示)快速、准确的鉴别出杜仲药材或原植物，该方法重现性好，效果明显，可以将杜仲药材或原植物与其易混品(如白杜、紫花络石、大果卫矛、大叶黄杨等植物枝叶、树皮)进行有效的区分，该方法不仅简化了分子鉴定的操作流程(现有的DNA条形码技术或序列分析法鉴别杜仲方法中测序过程繁琐，未经过专业培训的人员很难正确使用测序仪；另外，对于测序峰形图谱的好坏判断及如何分析测序结果，非分子生物学的操作人员难以独立完成)，而且具有快速(多数测序及测序结果的分析工作均是由专门的生物公司来进行，加上取样、送样等时间，滞后了鉴别工作)、成本低、稳定性高的优点；此外，本发明的检测方法的检测结果显而易见，当有样品需要鉴定时，提取样品基因组DNA后，用该组鉴别引物对此基因组DNA进行一次PCR反应，仅需电泳后在凝胶成像系统下观察400bp处条带的有无或加SYBRGreenI(由于SYBRGreenI能与所有双链DNA的小沟结合而产生绿色荧光，其对样本没有选择性，对PCR反应的质量要求较高，因此，使用荧光检测PCR反应产物时，需检测模板的质量，避免假阳性结果的出现)混匀后紫外光下观察绿色荧光产生与否即可达到准确鉴别样品真伪的目的，不受人为、环境等因素的影响。本发明操作简捷且能获得满意的结果，事半功倍、多快好省，实用性强，利于大规模杜仲药材或原植物的鉴别推广。

附图说明

图1为基因组DNA提取电泳图；

图2为部分退火温度的电泳检测图；

图3为与图2相应的荧光检测图；

图4为退火时间优化的电泳检测图；

图5为与图4相应的荧光检测图；

图6为变性、退火、延伸的循环次数优化的电泳检测图；

图7为与图6相应的荧光检测图；

图8为部分Taq酶预混液用量优化的电泳检测图；

图9为与图8相应的荧光检测图；

图10为引物用量优化电泳检测图；

图11为与图10相应的荧光检测图；

图12为不同厂家的Taq酶预混液扩增的电泳检测图；

图13为与图12相应的荧光检测图；

图14是进行杜仲药材的快速分子鉴别的方法流程图；

图15为效果验证实验的部分电泳检测图；

图16为与图15相应的荧光检测图；

图17为实施例1的部分电泳检测图；

图18为实施例3的部分荧光检测图；

图19为实施例5的部分电泳检测图。

具体实施方式

本发明的实施例1：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成如序列表中序列2和序列3所示的引物；提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品3mg，用植物DNA提取试剂盒提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7.5μL，序列表中序列2和序列3所示的引物(即上游引物和下游引物)各为10pmol，DNA模板80～120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95℃预变性45s，95℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72℃后延伸30s；PCR反应产物的检测：取5μLPCR扩增产物加入含EB的1.2％琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，紫外凝胶成像系统下观察。在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，在400bp处无条带出现的为非杜仲的其它植物材料。部分结果如图17所示(其中，M为Marker；CK为空白对照；1～4：dz-02、dz-05、dz-10、dz-14；5～8：bd-01、bd-02、bd-03、bd-04；9～12：dgwm-01、dgwm-02、dgwm-03、dgwm-04；13～16：zhls-01、zhls-02、zhls-03、zhls-04；17～20：dyhy-01、dyhy-02、dyhy-03、dyhy-04)。

实施例1中，进行PCR反应产物的检测也可采用以下方法：PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物，未产生绿色荧光的即为非杜仲的其它植物材料。

实施例2：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成如序列表中序列2和序列3所示的引物；提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品5mg，用CTAB提取法提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5～9μL，序列表中序列2和序列3所示的引物(即上游引物和下游引物)各为10～20pmol，DNA模板50～150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～95℃预变性0.5～2min，94～95℃变性2～10s，60～65℃退火2～15s，72～73℃延伸2～15s，变性、退火、延伸一共进行29～33次循环；最后72～73℃后延伸20～60s；PCR反应产物的检测：在PCR反应产物中加入2～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在340～380nm紫外光下观察；PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物，PCR反应产物未产生绿色荧光的即为非杜仲的其它植物材料。

实施例2中，PCR反应产物的检测也可采用以下方法：取5～6μLPCR扩增产物加入含EB的1.1％～1.3％琼脂糖凝胶中，70～85V稳压电泳35～45min后，紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，在400bp处无条带出现的即为非杜仲的其它植物材料。

实施例3：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成如序列表中序列2和序列3所示的引物，提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品2mg，碱裂解法提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5～11μL，序列表中序列2和序列3各为5～40pmol，DNA模板50～200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～96℃预变性0.5～5min，94～96℃变性2～30s，45～65℃退火2～30s，71～73℃延伸2～45s，变性、退火、延伸一共进行27～39次循环；最后71～73℃后延伸0.3～5min；PCR反应产物的检测：取4～7μLPCR扩增产物加入含EB的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，65～100V稳压电泳35～50min后，紫外凝胶成像系统下观察；在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，在400bp处无条带出现的即为非杜仲的其它植物材料。

实施例3中，PCR反应产物的检测也可采用以下方法：PCR反应产物中加入1～3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在300～400nm紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物，PCR反应产物未产生绿色荧光的即为非杜仲的其它植物材料。部分荧光检测结果如图18所示(其中，M为Marker；CK为空白对照；1～12：dz-01、dz-02、dz-04、dz-05、dz-06、dz-08、dz-09、dz-10、dz-11、dz-12、dz-13、dz-15；13～15：bd-01、bd-03、bd-04；16～18：dgwm-01、dgwm-03、dgwm-04；19～21：zhls-03、zhls-04、zhls-05；22～24：dyhy-01、dyhy-02、dyhy-03)。

实施例4：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成序列表中序列2和序列3所示的引物；提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品5mg，用CTAB提取法提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5～9μL，序列表中的序列2和序列3各为10～20pmol，DNA模板50～120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95～96℃预变性30～120s，95～96℃变性2～10s，60～65℃退火2～15s，72～73℃延伸2～15s，变性、退火、延伸一共进行27～33次循环；最后72～73℃后延伸20～60s；PCR反应产物的检测：在PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察；PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物，未产生绿色荧光的样品即为非杜仲的其它植物材料。

实施例5：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成序列表中序列2和序列3所示的引物，提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品2mg，碱裂解法提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5～9μL，序列表中序列2和序列3所示引物各为20～40pmol，DNA模板80～150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～96℃预变性2～5min，94～96℃变性15～30s，55～60℃退火15～30s，71～72℃延伸10～30s，变性、退火、延伸一共进行33～39次循环；最后71～72℃后延伸0.3～5min；PCR反应产物的检测：取5～6μLPCR扩增产物加入含EB的1.0％～1.5％琼脂糖凝胶中，65～100V稳压电泳35～50min后，紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，在400bp处无条带出现的即为非杜仲的其它植物材料。部分电泳检测图如图19所示(其中，M为Marker，CK为空白对照，1～12：dz-01、dz-03、dz-04、dz-05、dz-07、dz-08、dz-09、dz-10、dz-11、dz-12、dz-14、dz-15，13～15：bd-01、bd-02、bd-04，16～18：dgwm-01、dgwm-02、dgwm-04，19～21：zhls-01、zhls-02、zhls-05，22～24：dyhy-01、dyhy-03、dyhy-04)。

实施例6：杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，如图14所示，包括以下步骤：利用由序列表中序列1所示序列设计合成序列表中序列2和序列3所示引物，提取鉴别样品的基因组DNA(取鉴别样品4mg，用其他现有的方法提取)，用该基因组DNA作为模板，利用序列表中序列2和序列3所示的引物进行PCR反应；所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7～11μL，序列表中序列2和序列3所示引物各为15～25pmol，DNA模板100～200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94～96℃预变性2～5min，94～96℃变性15～30s，62～64℃退火5～15s，72～73℃延伸15～45s，变性、退火、延伸一共进行29～33次循环；最后72～73℃后延伸3～5min；PCR反应产物的检测：取5～6μLPCR扩增产物加入含EB的1.1％～1.3％琼脂糖凝胶中，70～85V稳压电泳35～45min后，紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的即为杜仲药材或原植物，在400bp处无条带出现的则为非杜仲的其他植物样品。

Claims

1.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的特异性DNA片段，其序列如序列表中序列1所示。

2.杜仲药材或原植物快速分子鉴别的一组引物，该组引物由序列表中序列1所示序列设计合成，其序列如序列表中序列2和序列3所示。

3.权利要求2所述的引物在杜仲药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。

4.包括权利要求2所述引物的试剂盒。

5.杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下方法进行鉴别：取4~7μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.0%~1.5%琼脂糖凝胶中，65~100V稳压电泳35~50min后，在紫外凝胶成像系统下观察，在400bp处出现条带的样品即为杜仲药材或原植物；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5~11μL，上游和下游引物各为5~40pmol，DNA模板50~200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94~96℃预变性30～300s，94~96℃变性2~30s，45~65℃退火2～30s，71~73℃延伸2~45s，变性、退火、延伸一共进行27~39次循环；最后71~73℃后延伸18～300s。

6.杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：利用序列为序列2和序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应；再采用以下方法进行鉴别：在PCR反应产物中加入1~3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在300～400nm紫外光下观察，PCR反应产物产生绿色荧光的样品即为杜仲药材或原植物；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液5~11μL，上游和下游引物各为5~40pmol，DNA模板50~200ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94~96℃预变性30～300s，94~96℃变性2~30s，45~65℃退火2～30s，71~73℃延伸2~45s，变性、退火、延伸一共进行27~39次循环；最后71~73℃后延伸18～300s。

7.根据权利要求5或6所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的对鉴别样品进行PCR反应包括：提取鉴别样品的基因组DNA，用该基因组DNA作为模板，利用序列为序列2和序列3所示的引物进行PCR反应。

8.根据权利要求7所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤：取鉴别样品2~5mg，用植物DNA提取试剂盒、CTAB提取法或碱裂解法提取基因组DNA。

9.根据权利要求5所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，采用以下方法进行鉴别：取5~6μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.1%~1.3%琼脂糖凝胶中，70~85V稳压电泳35~45min后，在紫外凝胶成像系统下观察；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5~9μL，上游和下游引物各为10~20pmol，DNA模板50~150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94~95℃预变性30～120s，94~95℃变性2~10s，60~65℃退火2~15s，72~73℃延伸2~15s，变性、退火、延伸一共进行29~33次循环；最后72~73℃后延伸20~60s。

10.根据权利要求9所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，采用以下方法进行鉴别：取5μLPCR反应产物加入含溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中，80V稳压电泳40min后，在紫外凝胶成像系统下观察；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7.5μL，上游和下游引物各为10pmol，DNA模板80~120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95℃预变性45s，95℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72℃后延伸30s。

11.根据权利要求6所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，采用以下方法进行鉴别：在PCR反应产物中加入2~3μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在340～380nm紫外光下观察；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液6.5~9μL，上游和下游引物各为10~20pmol，DNA模板50~150ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：94~95℃预变性30～120s，94~95℃变性2~10s，60~65℃退火2~15s，72~73℃延伸2~15s，变性、退火、延伸一共进行29~33次循环；最后72~73℃后延伸20~60s。

12.根据权利要求11所述的杜仲药材或原植物的快速分子鉴别方法，其特征在于，采用以下方法进行鉴别：在PCR反应产物中加入2μL100×SYBRGreenI核酸荧光染料，混匀后在365nm紫外光下观察；其中，所述的PCR反应体系为25μL，反应液组成为：Taq酶预混液7.5μL，上游和下游引物各为10pmol，DNA模板80~120ng，灭菌重蒸水加至25μL；反应程序为：95℃预变性45s，95℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸5s，变性、退火、延伸一共进行30次循环；最后72℃后延伸30s。