CN108220407A

CN108220407A - 检测人类gdf5、col5a1、sod2、crp基因多态性的引物对、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN108220407A
Application number: CN201810268165.5A
Authority: CN
Inventors: 吴宇亮; 李科铮; 陈婷; 李婵; 钟宇萍
Original assignee: Shenzhen Dingxin Fusion Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Dingxin Fusion Technology Co Ltd
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明公开了检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒，其用于扩增GDF5基因上的rs143383位点、COL5A1基因上的rs12722位点、SOD2基因上的rs4880位点及CRP基因上的rs1205位点的上游引物和下游引物依次如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:8所示。本发明试剂盒检测特异性强，灵敏度高，且操作简单，耗时短。其采用均相分析，无污染，具有检测效率高，成本低的优势。

Description

检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，涉及一种检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒，尤其涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒。

背景技术

运动损伤是指体育运动过程中受到机械性和物理性方面因素所造成的伤害，按损伤组织的种类分类可分为肌肉韧带的捩伤、撕裂、挫伤、四肢骨折、颅骨骨折、脊椎骨折、关节脱位、脑震荡、内脏破裂、烧伤、冻伤、溺水等。运动恢复是指运动后各种生理功能恢复到运动前的状态，包括自由基清除、炎症恢复等。研究表明，GDF5和COL5A1基因与软骨、韧带及肌腱的损伤风险密切相关；SOD2基因与清除自由基的能力密切相关；CRP基因与运动后炎症反应密切相关。近年来以上4个基因在运动损伤及恢复方面受到了广泛关注，具有广阔的应用前景。

GDF5是骨形态发生蛋白家族(BMPs)的成员，主要表达于关节软骨组织，它在软骨发生和长骨发育中具有重要作用。该基因上的rs143383位点位于该基因的5′UTR区，风险基因T能够减少GDF5启动子序列的翻译，也就是会减少GDF5的表达，而GDF5是一种从胚胎阶段就开始活跃，形成软骨的蛋白质。有研究表明，rs143383位点多态性与骨折易感性有关，携带T等位基因的人群，有容易发生骨折的风险。所以携带T等位基因的人群，平时需要更加注意确保运动前充分热身及相关营养钙、维生素D等的补给。

韧带和肌腱的主要结构成分都是胶原，特别是I型和V型。COL5A1基因指令身体产生胶原α-1链蛋白(V型胶原)，其在生成胶原过程中起着重要的作用。研究表明，COL5A1的3'UTR内的rs12722的多态性与韧带、肌腱损伤等相关。T等位基因(CT和TT型)的人群，在跟腱(十字韧带)、肌腱受伤方面存在着较高的风险；因此，这类人群运动前需要充分热身，运动时注意适度的运动强度，平时要加强营养，包括新鲜水果、蔬菜及胶原蛋白。CC基因型人群不易发生运动相关肌肉痉挛和前十字交叉韧带受损，这类人群肌腱和韧带受损的风险低。

SOD2基因上的rs4880的多态性与SOD2酶活性密切相关。大量研究表明，GG基因型的SOD2酶活性会降低33％。因此，GG基因型的人群在剧烈运动后，需要关注自身自由基的清除，通过服用抗氧化物(如维生素C、E,β-胡萝卜素、虾青素等)和各种青菜水果来中和体内的自由基。

CRP基因上的UTR区的rs1205位点的多态性与CRP蛋白表达水平密切相关。研究表明，TT基因型的CRP表达会降低20％，这类人群在高强度运动或运动损伤后炎症反应较弱，恢复较快；相反，CC基因型的人群CRP水平高，炎症反应很强烈，这类人群要注意在运动损伤后不要剧烈运动加重炎症反应，可通过补充维生素E、C和β胡萝卜素来减少C-反应蛋白。

目前，基因检测技术广泛的应用在无创产前基因检测、药物靶向治疗、遗传疾病的诊断和疾病风险评估。但研究运动相关基因的文献及专利就甚少，而随着生活水平的提高，越来越多的人参与到运动健身的队伍中来，这时研究运动相关的基因以帮助运动者了解自身的运动天赋及能力并加以注意或应用就显得尤为重要。目前，对基因突变、多态性的检测分析技术主要包括：等位基因特异寡核苷酸探针杂交法(ASO)、反向点杂交法(RDB)、基因芯片法、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、荧光定量PCR法、直接测序法、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、高分辨熔解曲线(HRM)等。不同的方法都有自身的局限性。如ASO检测一次只能检测一种突变，较为耗时；RDB是一种异相的突变检测方法，需要对PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响；基因芯片成本昂贵、难以普及；RFLP检测耗时耗力，对技术人员的专业要求很高；SSCP检测率易受电泳条件(如pH值，离子强度和温度等)的影响，其中温度的影响最为敏感，需要严格控制电泳温度；DHPLC检测通量比较低，一次进样只能检测一种突变；荧光定量PCR需荧光标记的特异性探针，一种探针只能进行一种基因突变类型的检测，因此检测试剂成本高，检测突变种类少，操作相对复杂；直接测序步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵；AS-PCR检测的通量十分有限，需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性；HRM不能轻易使用多重模式同时进行几个不同片段同时分型突变。

探针熔解曲线通过单链探针与扩增产物特异杂交的方式来提供熔解曲线。取代双链DNA自身在从低温到高温中的熔解过程，利用荧光探针与不同的单链靶序列杂交后形成的双链DNA熔解特征的差异来区分不同的靶序列。此技术无需染料，但要求探针在从低温到高温过程中，伴随着它与单链靶序列的结合与分离状态具有明显的荧光信号的变化，目前已常用于基因突变分析。对要检测的突变位点设计特异性探针，基于探针与互补碱基和非互补碱基形成之间的解离温度不同而将纯合野生型、杂合性和纯合突变型区分开来。探针熔解曲线的多个熔点分析联合多色荧光检测，是实现多重实时检测的重要途径。该技术探针针对已知序列设计，特异性强，且无需昂贵的HRM仪器，加上目前多数规格的实时荧光定量PCR仪均加装熔解分析模块，同时拥有扩增和熔解曲线分析两个功能，则可以达到定量和熔解曲线分析同步进行的目的，促使了探针熔解曲线的应用和发展。实时PCR联合探针熔解曲线已成为基因序列分析的常用技术。此外，该技术操作简单，均相分析无需PCR后处理，并且仪器自动分析，结果判读直观，同时具有灵敏度高等优势，具有广泛应用前景，尤其是在临床诊断方面具有相当巨大的发展空间。

目前还没有利用探针熔解曲线法进行有关人运动损伤及运动恢复的GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的多重检测方面的专利。

发明内容

本发明申请的目的在于解决现有技术的缺陷和不足，提供一种应用多重不对称荧光PCR熔解曲线分析检测有关人运动损伤及运动恢复的GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的检测引物、探针及试剂盒。

本发明提供了一种人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性检测的引物对，用于PCR特异性扩增GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因片段，所述引物对为：

用于特异性扩增人GDF5基因上的rs143383位点的上游引物F1和下游引物R1：

F1：5’-TGTTTGTATCCAGTCCCATAGTG-3’(SEQ ID NO:1)

R1：5’-TACAAGCCTCCTTCAAGCCC-3’(SEQ ID NO:2)

用于特异性扩增人COL5A1基因上的rs12722位点的上游引物F2和下游引物R2：

F2：5’-GAGAACAGAGGGAAGGAGCC-3’(SEQ ID NO:3)

R2：5’-ACCCCTGAGACCTATTCACG-3’(SEQ IS NO:4)

用于特异性扩增人SOD2基因上的rs4880位点的上游引物F3和下游引物R3：

F3：5’-CGTTGATGTGAGGTTCCA-3’(SEQ ID NO:5)

R3：5’-CTGTGCTTTCTCGTCTTC-3’(SEQ ID NO:6)

用于特异性扩增人CRP基因上的rs1205位点的上游引物F4和下游引物R4：

F4：5’-GGTCAAGGCTCTGTTGTTTGT-3’(SEQ ID NO:7)

R4：5’-CAGTAGCCATCTTGTTTGCCA-3’(SEQ ID NO:8)

进一步的，本发明还提供一种用于检测人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的荧光探针，该荧光探针为分子信标探针，所诉荧光探针包括：

用于检测人GDF5基因上的rs143383位点的分子信标荧光探针P1：

P1：5’-ROX-CCGCGAAAGCCGACCGCCCGCGG-BHQ2-3’(SEQ ID NO:9)

用于检测人COL5A1基因上的rs12722位点的分子信标荧光探针P2：

P2：5’-CY5-CGGCCACACCCACGCGCCCCGGCCG-BHQ2-3’(SEQ ID NO:10)

用于检测人SOD2基因上的rs4880位点的分子信标荧光探针P3：

P3：5'-FAM-CGCAGCCCCAAAGCCGGAGCCAGCTGCG-BHQ1-3'(SEQ ID NO:11)

用于检测人CRP基因上的rs1205位点的分子信标荧光探针P4：

P4：5’-HEX-CGCGTCCTCACAGTCTCTCTCCGCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:12)

进一步的，本发明还提供一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括引物对R1和F1、R2和F2、R3和F3、R4和F4及分子信标荧光探针P1、P2、P3、P4。

所述试剂盒还包括以下检测体系：

1×PCR Mix，上游引物F1、F2、F3、F4各0.1μM，下游引物R1、R2、R3、R4各1μM，分子信标荧光探针P1、P2、P3、P4各0.4μM。

其中，1×PCR Mix包含pH 8.3的Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl₂1.5mM，dNTP 200μM，HS Taq DNA聚合酶5U。

所述检测体系的PCR熔解曲线检测程序如下：

(1)95℃15min；

(2)94℃40s→65℃15s(-1℃/cycle)→72℃30s，15个循环；

(3)94℃40s→58℃15s→72℃30s，50个循环；

(4)95℃1min→35℃3min→40～87.5℃→40℃1s，其中，40～87.5℃以0.1℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段每0.3℃采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号。

本发明的有益效果是：

检测特异性强，灵敏度高。本发明针对人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因序列设计分子信标探针，检测特异性强；分子信标探针与靶序列互补的部分延伸到分子信标的臂，更容易与靶序列杂交，灵敏度高。

操作简单，耗时短。本发明可同时进行人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因的多态性检测，整个操作过程可在3-4小时内完成，耗时短。

均相分析，无污染。本发明为均相检测体系，PCR扩增和熔解曲线分析在同一管中完成，不需要开盖，避免污染导致的检测问题。

检测效率高，成本低。本发明可同时进行人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因的野生型、杂合突变及纯合突变检测，且无需昂贵的HRM仪器，加上目前多数规格的实时荧光定量PCR仪均加装熔解分析模块，同时拥有扩增和熔解曲线分析两个功能，则可以达到定量和熔解曲线分析同步进行的目的。

附图说明

图1为实施例中本发明试剂盒对人GDF5基因上的rs143383位点的熔解曲线检测结果图；

图2为实施例中本发明试剂盒对人COL5A1基因上的rs12722位点的熔解曲线检测结果图；

图3为实施例中本发明试剂盒对人SOD2基因上的rs4880位点的熔解曲线检测结果图；

图4为实施例中本发明试剂盒对人CRP基因上的rs1205位点的熔解曲线检测结果图。

图5为实施例中本发明试剂盒所检测的各基因对应的检测位点、检测通道及基因型判读列表。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

本发明提供一种检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒，具体的，使用本发明引物对、探针和试剂盒进行人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的检测步骤如下：

步骤1：采集人的口腔上皮细胞，提取DNA，DNA浓度达5ng/uL以上。

步骤2：将步骤1提取出来的DNA、阴性对照(NTC)分别加入到本发明的试剂盒检测体系中，按照试剂盒的PCR熔解曲线检测程序进行检测。具体如下：

试剂盒中检测体系包含：1×PCR Mix，上游引物F1、F2、F3、F4各0.1μM，下游引物R1、R2、R3、R4各1μM，分子信标荧光探针P1、P2、P3、P4各0.4μM。

其中，检测体系中的4对引物分别特异性扩增人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因片段，具体如下：

以下引物扩增人GDF5基因上的rs143383位点：

上游引物F1：5’-TGTTTGTATCCAGTCCCATAGTG-3’(SEQ ID NO:1)

下游引物R1：5’-TACAAGCCTCCTTCAAGCCC-3’(SEQ ID NO:2)。

以下引物扩增人COL5A1基因上的rs12722位点：

上游引物F2：5’-GAGAACAGAGGGAAGGAGCC-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物R2：5’-ACCCCTGAGACCTATTCACG-3’(SEQ IS NO:4)。

以下引物扩增人SOD2基因上的rs4880位点：

上游引物F3：5’-CGTTGATGTGAGGTTCCA-3’(SEQ ID NO:5)

下游引物R3：5’-CTGTGCTTTCTCGTCTTC-3’(SEQ ID NO:6)。

以下引物扩增人CRP基因上的rs1205位点：

上游引物F4：5’-GGTCAAGGCTCTGTTGTTTGT-3’(SEQ ID NO:7)

下游引物R4：5’-CAGTAGCCATCTTGTTTGCCA-3’(SEQ ID NO:8)。

其中，检测体系中的4个分子信标探针分别检测人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因的多态性，具体如下：

以下探针检测人GDF5基因上的rs143383位点的多态性：

P1：5’-ROX-CCGCGAAAGCCGACCGCCCGCGG-BHQ2-3’(SEQ ID NO:9)

以下探针检测人COL5A1基因上的rs12722位点的多态性：

P2：5’-CY5-CGGCCACACCCACGCGCCCCGGCCG-BHQ2-3’(SEQ ID NO:10)

以下探针检测人SOD2基因上的rs4880位点的多态性：

P3：5'-FAM-CGCAGCCCCAAAGCCGGAGCCAGCTGCG-BHQ1-3'(SEQ ID NO:11)

以下探针检测人CRP基因上的rs1205位点的多态性：

P4：5’-HEX-CGCGTCCTCACAGTCTCTCTCCGCG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:12)。

试剂盒的PCR熔解曲线检测程序如下。其中，模板加入量为2ul；阴性对照成分为：20mM Tris-EDTA缓冲液(pH＝8.3)，加入量也是2ul。检测过程中所使用的设备为Bio-RadCFX96实时荧光PCR仪。

(1)95℃15min；

(2)94℃40s→65℃15s(-1℃/cycle)→72℃30s，15个循环；

(3)94℃40s→58℃15s→72℃30s，50个循环；

(4)95℃1min→35℃3min→40～87.5℃→40℃1s，其中，40～87.5℃以0.1℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段每0.3℃采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号。具体实施例中，图1为本发明试剂盒的FAM荧光通道的GDF5基因检测结果图；图2为本发明的试剂盒的HEX荧光通道的COL5A1基因检测结果图；图3为本发明的试剂盒的ROX荧光通道的SOD2基因检测结果图；图4为本发明的试剂盒的CY5荧光通道的CRP基因检测结果图。

使用本发明的试剂盒可以同时检测出有关人运动损伤及运动恢复的GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性，包括各基因的纯合野生型、纯合突变型及杂合型。各基因对应的检测位点、检测通道及基因型判断如图5所示。ΔTm值为纯合野生型与纯合突变型Tm值的差异，各位点对应的ΔTm值较高，判读准确率也较高，不容易出现判读错误。在检测样本时，可根据图5中对应的Tm值判读待测样本的基因型。

本发明检测试剂盒针对人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因序列设计分子信标探针，检测特异性强；分子信标探针与靶序列互补的部分延伸到分子信标的臂，更容易与靶序列杂交，灵敏度高。另外本发明可同时进行人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因的多态性检测，整个操作过程可在3-4小时内完成，耗时短，操作简单。并且本发明检测试剂盒采用均相检测体系，PCR扩增和熔解曲线分析在同一管中完成，不需要开盖，可避免污染导致的检测问题。本发明检测试剂盒可同时进行人GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因的野生型、杂合突变及纯合突变检测，且无需昂贵的HRM仪器，加上目前多数规格的实时荧光定量PCR仪均加装熔解分析模块，同时拥有扩增和熔解曲线分析两个功能，可以达到定量和熔解曲线分析同步进行的目的。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳鼎新融合科技有限公司

<120> 检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对、探针及试剂盒

<130> HZ1810275-ZHY

<141> 2018-03-29

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 1

tgtttgtatc cagtcccata gtg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 2

tacaagcctc cttcaagccc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 3

gagaacagag ggaaggagcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 4

acccctgaga cctattcacg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 5

cgttgatgtg aggttcca 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 6

ctgtgctttc tcgtcttc 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 7

ggtcaaggct ctgttgtttg t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 8

cagtagccat cttgtttgcc a 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 9

ccgcgaaagc cgaccgcccg cgg 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 10

cggccacacc cacgcgcccc ggccg 25

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 11

cgcagcccca aagccggagc cagctgcg 28

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence )

<400> 12

cgcgtcctca cagtctctct ccgcg 25

Claims

1.一种检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的引物对，用于PCR特异性扩增GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因片段，其特征在于，用于特异性扩增人GDF5基因上的rs143383位点的上游引物F1如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，下游引物R1如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增人COL5A1基因上的rs12722位点的上游引物F2如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，下游引物R2如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增人SOD2基因上的rs4880位点的上游引物F3如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，下游引物R3如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

用于特异性扩增人CRP基因上的rs1205位点的上游引物F4如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，下游引物R4如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

2.一种检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性探针，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性探针，其特征在于，该探针为分子信标荧光探针，所述探针包括：

用于检测人GDF5基因上的rs143383位点的分子信标荧光探针P1为如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；

用于检测人COL5A1基因上的rs12722位点的分子信标荧光探针P2为如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；

用于检测人SOD2基因上的rs4880位点的分子信标荧光探针P3为如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；

用于检测人CRP基因上的rs1205位点的分子信标荧光探针P4为如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

3.一种检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对R1和F1、R2和F2、R3和F3、R4和F4，以及如权利要求2所述的分子信标荧光探针P1、P2、P3、P4。

4.根据权利要求3所述的检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括以下检测体系：

1×PCR Mix，其中包含pH 8.3的Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 1.5mM，dNTP 200μM，HS Taq DNA聚合酶5U；

上游引物F1、F2、F3、F4各0.1μM，下游引物R1、R2、R3、R4各1μM，分子信标荧光探针P1、P2、P3、P4各0.4μM。

5.根据权利要求4所述的检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，涉及一种多重不对称荧光PCR熔解曲线法检测人类GDF5、COL5A1、SOD2、CRP基因多态性的试剂盒，其特征在于，利用试剂盒进行PCR熔解曲线检测程序如下：

1)95℃15min；

2)94℃40s→65℃15s(-1℃/cycle)→72℃30s，15个循环；

3)94℃40s→58℃15s→72℃30s，50个循环；

4)95℃1min→35℃3min→40～87.5℃→40℃1s，其中，40～87.5℃以0.1℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段每0.3℃采集FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号。