CN102321767A

CN102321767A - 基于ssr-pcr的油菜杂交种种子纯度检测方法

Info

Publication number: CN102321767A
Application number: CN201110317531A
Authority: CN
Inventors: 王同华; 陈卫江; 李莓; 曲亮; 范连益; 惠荣奎
Original assignee: HU'NAN PROV CROPS RESEARCH INST
Current assignee: HU'NAN PROV CROPS RESEARCH INST
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明公开了一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度鉴定方法，包括以下步骤：取待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，加入提取缓冲液后得到基因组DNA溶液；利用SSR引物序列对基因组DNA进行PCR扩增；PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行稳压电泳分离；电泳分离后的PCR扩增产物置于凝胶成像系统中成像、读带，将样品种子的谱带特征与其父母本种子进行比对，统计出样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量，再根据品种纯度公式即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。本发明的鉴定方法具有快速简便、高通量、检测成本低、检测效率高、检测结果稳定可靠等优点。

Description

基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法

技术领域

本发明属于油菜育种与应用技术领域，具体涉及一种油菜杂交种种子纯度的检测方法。

背景技术

甘蓝型油菜具有明显的超亲优势，是杂种优势利用最为成功的作物之一。我国从20世纪80年代开始推广应用第一个甘蓝型油菜杂交品种秦油2号以来，杂交品种得到迅速普及，极大地提高了我国的油菜生产水平。但是，目前油菜杂交制种普遍采用pol-CMS系统，其母本不育系属低温敏感型，若花期遇低温天气，易产生微量花粉，并自交产生不育假杂种，从而导致杂交种种子纯度质量下降，严重时可造成生产上油菜产量大幅度降低。因此，油菜杂交种应用于生产之前必须进行严格的纯度鉴定，特别是针对杂交种中不育母本种子的鉴定，才能保证我国的油菜生产安全。

长期以来，油菜杂交种纯度检测主要采用传统的种植鉴定法，即根据形态特征和育性来判断样品的纯度，鉴定周期长，耗费人力、物力巨大，且结果往往受环境和人为的因素影响较大。20世纪80年代开始，生化技术开始被应用于油菜杂交种纯度检测工作，以酯酶同工酶和醇溶蛋白电泳技术为代表的生化标记鉴定技术，不仅大大缩短了鉴定周期，而且鉴定结果准确可靠，已成为油菜杂交种纯度检测的一种主要方法。但是，该类标记技术检测成本相对较高，而且其遗传信息量非常有限，在大部分杂交油菜的父母本间显示不出差异，决定了其只能应用于少数油菜杂交品种的纯度检测；近年来，迅速发展的分子标记技术给油菜杂交种纯度检测工作开辟了新途径，特别是SSR标记技术，不仅操作相对简单，而且具有丰富的遗传信息量，在理论上，只要筛选到合适的引物，可以应用于任何油菜品种的纯度检测，这已成为目前油菜杂交种纯度检测工作的首选分子标记技术，并在部分高校及科研单位得到了应用。

然而，现有的油菜杂交种SSR-PCR纯度检测方法操作步骤繁琐，耗费大量人力和时间，且需要具备一定实验技能的人员进行操作；另一方面该方法所需仪器、试剂和耗材非常昂贵，一般规模的种子企业难以构建检测体系和承受检测成本。因此，现有SSR标记检测方法不适合于目前大规模商业化杂交种制种纯度检测需要，更不可能普及应用于小型种子企业。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速简便、高通量、检测成本低、检测效率高、检测结果稳定可靠的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，包括以下步骤：

(1)DNA提取：取数量为N(N的取值根据我国农作物种子检验规程的扦样标准(GB/T3543.2)确定即可)的待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养后的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，再加入提取缓冲液(如Tris-HCl缓冲液溶液)，混匀后即得到所述杂交种样品种子的基因组DNA溶液；

(2)PCR扩增：利用SSR引物序列对步骤(1)中所述杂交种样品种子的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)电泳分离：将步骤(2)中PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行稳压电泳分离；

(4)显带读数：将步骤(3)中电泳分离后的凝胶置于凝胶成像系统中成像、读带，将所述杂交种样品种子的谱带特征与其父母本种子的谱带特征进行比对，统计出所述杂交种样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量n，再根据公式“品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％”即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。如果父本谱带特征或母本谱带特征事先未经确认，可以在步骤(1)的样品中同时加入少量的父母本种子进行培养，以便在最后的显带读数步骤中同时获得父、母本的谱带特征，用于与杂交种种子的谱带特征进行比对。

上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法中，所述超声波破碎处理优选是在加满水的超声波洗涤器中进行，超声波破碎处理时的水温优选控制在65℃～80℃，超声波破碎的功率优选控制在200W～250W，超声波破碎处理的时间优选为5min～20min。

上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法中，所述SSR引物序列优选包括以下八种引物对中的任意一种：

引物对1：正向引物序列(5′→3′)：AAGAACGTCAAGATCCTCTGC；

反向引物序列(5′→3′)：ACCACCACGGTAGTAGAGCG；

引物对2：正向引物序列(5′→3′)：AGCCTTGTTGCTTTTCAACG；

反向引物序列(5′→3′)：AGTGAATCGATGATCTCGCC；

引物对3：正向引物序列(5′→3′)：AAAGGACAAAGAGGAAGGGC；

反向引物序列(5′→3′)：TTGAAATCAAATGAGAGTGACG；

引物对4：正向引物序列(5′→3′)：GCGTTCTAGGGTTTGTGGGA；

反向引物序列(5′→3′)：GAGGAAGTGAGAGCGGGAAATCA；

引物对5：正向引物序列(5′→3′)：CCAGGTTACTGTTAAAGAATAAGAGAG；

反向引物序列(5′→3′)：ATCGTCTGCGAGTCTCCTTG；

引物对6：正向引物序列(5′→3′)：AAGCTGTTCGATGAAATGCC；

反向引物序列(5′→3′)：ACTTGTTTGCATCCATTGCC；

引物对7：正向引物序列(5′→3′)：TCGGGGTTTGTTGTGAGG；

反向引物序列(5′→3′)：GAGGAGGATGCTAAGAGTGAGC；

引物对8：正向引物序列(5′→3′)：CGGTCAGATTCCAACAGA；

反向引物序列(5′→3′)：GCCATCTCAGAGACGACA。

作为对上述技术方案的进一步改进，利用所述引物对1对品种名称为丰油701、丰油730、湘杂油2号或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对2对品种名称为丰油701或沣油737的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对3对品种名称为沣油737、沣油520、丰油730、沣油5103或沣油827的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对4对品种名称为丰油730或沣油5103的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对5对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对6对品种名称为沣油792的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对7对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对8对品种名称为沣油737、沣油792或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定。

上述优选的技术方案中，各个引物对与适宜检测的油菜杂交品种的对应关系可归纳为下表1。

表1：SSR引物核苷酸序列与检测品种的最优化匹配

上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，所述PCR扩增过程中的循环参数优选为：994℃预变性1min～2min，94℃变性15～20sec，60℃退火15sec～20sec，72℃延伸30sec～40sec，此后每循环退火温度降低0.5℃，共计10个循环；94℃变性15sec～20sec，55℃退火15sec～20sec，72℃延伸30sec～40sec，共27个循环；72℃延伸5min～7min，4℃保存。

上述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，所述电泳分离步骤中用到的电泳槽装置优选为琼脂糖水平电泳槽装置，所述琼脂糖水平电泳槽装置中灌注有质量分数为3.0％～3.5％的琼脂糖凝胶，所述稳压电泳时的电压优选控制在100～120V。

与现有技术相比，上述本发明的技术方案的特点在于：首先，将超声波破碎技术和碱裂解技术结合应用，创造性地提出了一种新的油菜基因组DNA的快速提取方法，该快速提取方法的基本原理主要是根据超声波的机械振动产生的水冲击波与碱液(如NaOH)共同作用破坏油菜的幼嫩组织及细胞，进而快速释放基因组DNA。该快速提取方法为本发明油菜杂交种种子纯度的鉴定过程提供了便利和基本前提，这也为其他需要提取油菜基因组DNA的应用场合提供了新途径。另外，在本发明优选的技术方案中，经过我们的反复实验和对鉴定结果的比对，我们从数量众多的基因库中筛选并确立了一套适合油菜杂交种纯度检测的多态性好、特异性高的SSR引物序列，我们还进一步改良、简化了现有的SSR-PCR扩增与检测技术，可快速、有效地计算出送检油菜杂交种样品的纯度。本发明技术方案的理论基础是根据甘蓝型油菜基因组DNA上分布的微卫星序列(SSR)间的遗传差异，通过PCR扩增检测，分析杂交种与父母本的遗传差异，在理论上只要筛选到合适的引物，该技术可用于任何油菜杂交品种的纯度鉴定。据此，本发明形成了一套简易、完整的基于SSR-PCR的甘蓝型油菜杂交品种纯度检测方法，将本发明的鉴定方法和筛选的特定引物对应用于本发明上述优选确立的11个油菜杂交品种的商业化杂交制种生产检测，已经取得了非常明显和突出的技术效果。

与目前已有的油菜SSR-PCR鉴定方法相比，本发明的优点在于：

(1)本发明中的样品基因组DNA提取，只需两种廉价的提取液，且不需研磨和离心，省去了对DNA磨样仪和高速离心机等昂贵仪器设备的配置需求，不仅极大地节约了检测成本，同时大幅度减少了工作量，提高了工作效率；

(2)本发明简化并改良了PCR扩增反应程序，将扩增时间大大缩短，比现有的SSR-PCR扩增程序用时减少1个小时，极大地提高了PCR扩增仪的利用效率；

(3)本发明的PCR扩增产物检测采用琼脂糖凝胶电泳进行，一方面可采取在一块凝胶上重复点样的办法，另一方面凝胶可重复利用4～5次，不仅节约了成本，而且减少了试剂的配制次数，相对于目前的聚丙烯酰胺凝胶电泳，更适合应用于高通量分析。

利用本发明的纯度检测方法检测的结果与田间种植、醇溶蛋白电泳及目前标准的SSR检测方法进行对比分析，结果显示本发明方法比田间种植检测结果更稳定、可靠，比醇溶蛋白电泳适应范围更广、区分父母本的能力更强，与目前标准的SSR检测方法相比具有相同甚至更优的准确性和可靠性，更重要的是，本发明的检测方法操作更为简单、检测成本更低、检测效率更高，更易于在规模较小的种业公司和科研单位进行普及应用。

附图说明

图1为基于本发明的DNA提取技术的SSR-PCR检测效果，其中泳道1～5为基于本发明的DNA提取技术的PCR扩增产物，泳道6～10为基于经典CTAB小样法DNA提取技术的PCR扩增产物。

图2为本发明实施例中丰油730杂交种部分样品的SSR-PCR检测结果。

图3为本发明实施例中丰油701杂交种部分样品的SSR-PCR检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例：

利用本发明的检测方法对湖南省作物研究所选育的3个甘蓝型油菜杂交品种丰油701、丰油730和沣油5103的杂交种制种样品纯度进行检测，并验证该方法的检测效果，具体步骤如下：

1.配制主要试剂。

(1)0.25mol/L NaOH溶液：取1g固体NaOH(分析纯)，用双蒸水(ddH₂O)溶解，并定容至100ml，常温保存。

(2)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶液(pH＝8.0)：取12.11g三羟甲基氨基甲烷(分析纯)和4.2ml浓盐酸(分析纯)置于容量为1000ml的烧杯中，加800ml双蒸水，搅拌至充分溶解，最后用双蒸水定容至1000ml，常温保存。

(3)1×TAE缓冲液：取4.84g三羟甲基氨基甲烷(分析纯)和0.744gNa₂EDTA·2H₂O(分析纯)置于容量为1000ml的烧杯中，加1.142ml冰乙酸(分析纯)和800ml双蒸水，搅拌至充分溶解，最后用双蒸水定容至1000ml，4℃保存。

(4)6×TAE缓冲液：取29.04g三羟甲基氨基甲烷(分析纯)和4.464gNa₂EDTA·2H₂O(分析纯)置于容量为1000ml的烧杯中，加6.852ml冰乙酸(分析纯)和800ml双蒸水，搅拌至充分溶解，最后用双蒸水定容至1000ml，4℃保存；

(5)6×上样缓冲液：取25mg溴酚蓝(分析纯)和3ml丙三醇(分析纯)，用上述6×TAE缓冲液定容至100ml，常温保存。

(6)溴化乙锭溶液：取50mg溴化乙锭，充分溶解于双蒸水后，定容至100ml，常温避光保存。

(7)3％的琼脂糖凝胶：取3g琼脂糖于200ml的锥形瓶中，加97ml 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解。

2.DNA提取。

取甘蓝型油菜杂交品种丰油701、丰油730和沣油5103的杂交制种样品各N粒(本实施例为200～300粒)及各自的父、母本种子5～10粒；置于铺有5层吸水纸的培养皿中，30℃～35℃发芽4～7天后；取发芽后的幼嫩植株于1.5ml的离心管中，并加入150μl～200μl浓度为0.25mol/L NaOH溶液；然后将离心管悬浮于加满水的超声波洗涤器(北京六一仪器厂，WD9415B型)中，洗剂5min～10min(水温控制在65℃～80℃，功率控制在200W～250W)；再加入3倍上述NaOH溶液体积、摩尔浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液液(pH＝8.0)，并充分混匀，混匀液即为包含样品基因组DNA的溶液。

将上述丰油701的母本DNA溶液与经典的CTAB小量法提取的DNA溶液用SSR引物1同时进行PCR扩增，以验证本实施例DNA提取方法的效果。图1为两种DNA提取方法的SSR-PCR扩增产物电泳分离效果，由图可见PCR产物的谱带亮度基本相同，即两种方法提取的DNA在SSR-PCR检测中的效果无明显差异。

3.PCR扩增。

采用附表1中序所示SSR引物序列(丰油701用引物1，丰油730用引物3，沣油5103用引物4)，对上述杂交种样品及父母本基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系中，反应总体积为10μl∶1μl模板DNA，1μl 10×Buffer(含Mg²⁺)，正向、反向SSR引物各35ng，0.2μl 10mmol/LdNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，加ddH₂O至10μl，用10μl矿物油覆盖。

PCR循环参数为：94℃预变性2min，94℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，此后每循环退火温度降低0.5℃，共计10个循环；94℃变性15sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec，共27个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增结束后，往PCR产物中加1～2μl 6×上样缓冲液，4℃保存备用。

4.电泳检测。

选用一琼脂糖水平电泳槽装置(北京六一仪器厂DYCP-31型)，按说明书组装好胶模，形成胶室，插好点样梳；向完全熔化的琼脂糖凝胶中加10μl溴化乙锭溶液，充分摇匀，置于室温下冷却至70℃左右，再将质量分数为3.5％的琼脂糖凝胶灌入上述组装好的胶模中，凝固30min后，拔出点样梳，将凝胶置于配套的电泳槽中，并用1×TAE缓冲液浸没凝胶；取步骤3中的PCR扩增产物6μl～9μl上样于点样孔中，上样完毕后控制电压为100V～120V条件下稳压电泳，待溴酚蓝下移至凝胶底部时结束电泳。

5.显带、读数。

电泳结束后，从电泳槽中取出上述琼脂糖凝胶，并置于凝胶成像系统中成像、读带，对比待测的油菜杂交种及其父、母本种子的谱带特征，统计出油菜杂交种种子样品中具有母本或父本谱带特征的种子数量n，根据以下计算公式计算出各油菜杂交种种子的纯度，所述计算公式为：品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％。

以本实施例中的丰油730杂交种部分样品为例，图2为本实施例中丰油730杂交种部分样品的SSR-PCR检测结果，其中泳道A代表母本，泳道R代表父本，泳道1～22为杂交种样品，由图2可见，其中的泳道18为混入的母本假杂种。

以本实施例中的丰油701杂交种部分样品为例，图3为本实施例中丰油701杂交种部分样品的SSR-PCR检测结果，其中泳道A代表母本，泳道R代表父本，泳道1～22为杂交种样品，由图3可见，其中的泳道1、7、10、13、17、18、21、22均为混入的母本假杂种。

6.鉴定效果检验

同时，将上述丰油701、丰油730和沣油5103杂交种制种样品进行了田间种植、醇溶蛋白电泳检测，进行效果验证。其中，田间种植鉴定在盛花期根据育性表现调查纯度，每样品调查250～300株，种植鉴定的杂交种种子纯度计算公式为：

品种纯度(％)＝(1-不育株数/总调查株数)×100％；

醇溶蛋白根据母本与杂交种样品种子的醇溶蛋白谱带差异进行，每样品检测160粒种子；醇溶蛋白电泳检测的杂交种种子纯度计算公式为：

品种纯度(％)＝(1-具父母和母本谱带特征的个体数量/总检测数量)×100％；

上述三种检测方法的检测结果见下表2。

表2：三种检测方法对甘蓝型油菜杂交种纯度的检测结果对比

根据上表2的检测结果可见，利用上述三种检测方法对不同品种、不同纯度级别的杂交种制种样品的检测结果均比较吻合，这充分表明本发明的检测方法在油菜杂交种种子纯度鉴定上具有很好的可靠性；从检测周期的长短上考虑，本发明检测方法和醇溶蛋白电泳检测周期比种植鉴定大大缩短；而从应用的广泛性来讲，本发明方法的检测方法具醇溶蛋白电泳检测无法比拟的检测能力，在理论上可应用于任何甘蓝型油菜杂交种的纯度检测。综上所述，本发明的检测方法是目前最理想的、最具应用前景的甘蓝型油菜杂交品种纯度鉴定方法。

Claims

1.一种基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度鉴定方法，包括以下步骤：

(1)DNA提取：取数量为N的待测油菜杂交种样品种子进行发芽培养，将培养后的幼苗进行碱裂解，同时进行超声波破碎处理，再加入提取缓冲液，混匀后得到所述杂交种样品种子的基因组DNA溶液；

(4)显带读数：将步骤(3)中电泳分离后的凝胶置于凝胶成像系统中成像、读带，将所述杂交种样品种子的谱带特征与其父母本种子的谱带特征进行比对，统计出所述杂交种样品种子中具有父本谱带特征和母本谱带特征的种子数量n，再根据公式“品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％”即可得到待测油菜杂交种样品的纯度。

2.根据权利要求1所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于：所述超声波破碎处理是在加满水的超声波洗涤器中进行，超声波破碎处理时的水温控制在65℃～80℃，超声波破碎的功率控制在200W～250W，超声波破碎处理的时间为5min～20min。

3.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述SSR引物序列包括以下八种引物对中的任意一种：

引物对1：正向引物序列(5′→3′)：AAGAACGTCAAGATCCTCTGC；

反向引物序列(5′→3′)：ACCACCACGGTAGTAGAGCG；

引物对2：正向引物序列(5′→3′)：AGCCTTGTTGCTTTTCAACG；

反向引物序列(5′→3′)：AGTGAATCGATGATCTCGCC；

引物对3：正向引物序列(5′→3′)：AAAGGACAAAGAGGAAGGGC；

反向引物序列(5′→3′)：TTGAAATCAAATGAGAGTGACG；

引物对4：正向引物序列(5′→3′)：GCGTTCTAGGGTTTGTGGGA；

反向引物序列(5′→3′)：GAGGAAGTGAGAGCGGGAAATCA；

引物对5：正向引物序列(5′→3′)：CCAGGTTACTGTTAAAGAATAAGAGAG；

反向引物序列(5′→3′)：ATCGTCTGCGAGTCTCCTTG；

引物对6：正向引物序列(5′→3′)：AAGCTGTTCGATGAAATGCC；

反向引物序列(5′→3′)：ACTTGTTTGCATCCATTGCC；

引物对7：正向引物序列(5′→3′)：TCGGGGTTTGTTGTGAGG；

反向引物序列(5′→3′)：GAGGAGGATGCTAAGAGTGAGC；

引物对8：正向引物序列(5′→3′)：CGGTCAGATTCCAACAGA；

反向引物序列(5′→3′)：GCCATCTCAGAGACGACA。

4.根据权利要求3所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，利用所述引物对1对品种名称为丰油701、丰油730、湘杂油2号或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对2对品种名称为丰油701或沣油737的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对3对品种名称为沣油737、沣油520、丰油730、沣油5103或沣油827的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对4对品种名称为丰油730或沣油5103的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对5对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对6对品种名称为沣油792的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对7对品种名称为沣油682或沣油823的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定；利用所述引物对8对品种名称为沣油737、沣油792或湘杂油4号的油菜杂交种种子样品的纯度进行鉴定。

5.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述PCR扩增过程中的循环参数为：94℃预变性1min～2min，94℃变性15～20sec，60℃退火15sec～20sec，72℃延伸30sec～40sec，此后每循环退火温度降低0.5℃，共计10个循环；94℃变性15sec～20sec，55℃退火15sec～20sec，72℃延伸30sec～40sec，共27个循环；72℃延伸5min～7min，4℃保存。

6.根据权利要求1或2所述的基于SSR-PCR的油菜杂交种种子纯度检测方法，其特征在于，所述电泳分离步骤中用到的电泳槽装置为琼脂糖水平电泳槽装置，所述琼脂糖水平电泳槽装置中灌注有质量分数为3.0％～3.5％的琼脂糖凝胶，所述稳压电泳时的电压控制在100V～120V。