CN107299098A - 一种高效快速提取农作物基因组dna的方法 - Google Patents

一种高效快速提取农作物基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，具体包括如下步骤：取农作物单粒种子发芽后长出的根系、幼苗或叶片于容器中，加入碱性溶液和钢珠后进行研磨裂解，得到均浆；向所得裂解液中加入Tris缓冲溶液后收集上层清液。相比现有的碱性裂解方法，本方法在碱性研磨裂解过程中加入TritonX‑100溶液或NP40溶液使得DNA提取更简单快捷，提取质量更高，提取效果更好；因加入Tris缓冲溶液，避免因提取的DNA溶液pH值偏高或偏低对后续PCR反应的影响，只需加入两种溶液即可提取出较高质量的DNA；省略高温水浴过程，只需两步即可实现DNA的高效提取。本发明建立的方法适用于农作物单粒种子纯度、真实性、转基因成分快速检测及农作物关键性状分子标记辅助选择研究。

Description

一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于DNA提取技术领域，具体涉及一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，尤其是适合高效快速提取农作物单粒种子DNA的方法。
背景技术
随着生物技术的迅猛发展，基于PCR技术的分子生物学技术，如QTLs定位、基因克隆、分子标记辅助选择、转基因植株检测等在农作物关键性状研究与育种实践中得到广泛应用，而这些技术的应用离不开基因组DNA的提取。
植物组织中DNA的分离，需要打破细胞壁的阻碍，将DNA从细胞膜中释放出来，并与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。然而，目前常用的DNA提取方法，如CTAB法、SDS法、苯酚法等，存在操作复杂、耗时费力、有害试剂影响操作者的身体健康和污染环境等诸多缺陷，不适合批量样品的快速分析及微量样品的精准鉴定。同时，随着PCR技术的不断成熟，DNA聚合酶的保真度越来越高，PCR反应对DNA浓度和纯度的要求逐渐降低，这也允许DNA提取方法进行更多的简化和改进。因此发明一种简单快速，经济环保，适合农作物单粒种子精准分析的的高通量DNA提取方法具有很大应用前景。
碱裂解法是一种简单有效的DNA快速提取方法。它的原理是利用碱性环境使膜蛋白变性，DNA从细胞膜中释放出来，从而达到分离DNA的目的。现有的碱裂解法有些只加入碱性溶液进行变性裂解，提取的DNA溶液因pH偏高会阻碍后续PCR反应；有些在加入碱性溶液后会加入HCl溶液进行中和，但只加HCl溶液又存在使提取的DNA溶液pH偏低，影响后续PCR反应的潜在风险；有些加入HCl溶液后再加Tris缓冲溶液调整pH值，步骤和试剂都明显增多；且以上这些方法均需在高温水浴中完成碱性裂解细胞，提取DNA的过程。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，尤其是高效快速提取农作物单粒种子DNA的方法，力求简单快速，经济环保，适合DNA的高通量提取。
为解决上述问题，本发明在于提供一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，具体包括如下步骤：
1)取农作物单粒种子发芽后长出的根系、幼苗或叶片于容器中，加入碱性溶液和钢珠后进行研磨，得到均浆；
2)向步骤1)所得裂解液中加入Tris缓冲溶液后收集上层清液。
进一步地，所述容器可以是96孔板或2mL离心管等。
进一步地，所述农作物可以是水稻、玉米、小麦、大豆、油菜、辣椒和西瓜等。
更进一步地，所述农作物单粒种子发芽后长出的根系、幼苗或叶片的获取方法如下：
1)水稻：种子浸种12～24h，置发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天即可；
2)玉米：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天即可；
3)小麦：种子置发芽床上，20℃发芽4～8天即可；
4)大豆：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽5～8天即可；
5)油菜：种子置发芽床上，15℃～25℃发芽5～7天即可；
6)辣椒：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽7～14天即可；
7)西瓜：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽5～14天即可。
进一步地，所述碱性溶液为NaOH溶液和Triton X-100溶液的混合溶液。
更进一步地，所述混合溶液中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，优选0.1mol/L。
更进一步地，所述混合溶液中，所述Triton X-100溶液的体积浓度为0.5％～1.5％。优选为1％。
进一步地，所述碱性溶液为NaOH溶液和NP40溶液的混合溶液。
更进一步地，所述混合溶液中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，优选0.1mol/L。
更进一步地，所述混合溶液中，所述NP40溶液的体积浓度为0.5％～1.5％。优选为1％。
进一步地，所述研磨的强度为60～70Hz，研磨的时间为60～90s。使用离心管进行研磨时，研磨强度优选60Hz，研磨时间优选60s；使用96孔板进行研磨时，研磨强度优选70Hz，研磨时间优选90s。
进一步地，所述碱性溶液和Tris缓冲溶液的体积比为1:1。
进一步地，所述Tris缓冲溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，优选浓度为0.1mol/L。
进一步地，所述Tris缓冲溶液的pH值为8.0～10.0，优选pH值为8.0。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，首先，本方法在不需要加入HCl溶液，只需加入Tris缓冲溶液调整pH值的情况下，获得的DNA质量完全满足PCR反应的需要，有效减少酸的摄入从而避免DNA溶液pH值偏低对PCR反应的影响；其次，本方法加入的碱性溶液采用NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液，提升破壁速度和细胞膜、蛋白质变性速度同时保证提取的效果；或本方法加入的碱性溶液采用NaOH溶液和NP40溶液的混合溶液，促进细胞破碎释放出基因组DNA，同时保证提取的效果；再次，本方法省略高温水浴过程，只需碱性研磨裂解后，加入Tris缓冲溶液收集上层清液2步，简化提取步骤，降低试剂成本，缩短提取时间；第四，本方法适用于单粒种子的DNA提取，将单粒种子发芽后直接用于提取该种子的DNA，实现单粒种子的DNA快速提取，且提取的DNA完全满足PCR反应的要求。
本发明的方法与传统的DNA提取方法相比，省去离心、沉淀和抽提等过程，通过研磨破除细胞壁，利用碱性环境加速细胞膜破裂和蛋白质变性，实现DNA的快速提取，且提取后的DNA可直接用于PCR扩增。DNA的提取步骤由传统的5～8步减少为2步，提取时间由传统的5h以上缩短为1～1.5min，样品的提取成本也显著降低，同时避免了有害试剂对操作者的身体健康和环境污染的影响。
本发明的方法相比现有的碱裂解法，因加入Tris缓冲溶液，可以调整提取的DNA溶液pH值，避免因pH值偏高(只加碱性溶液)或偏低(加入碱性溶液后加HCl溶液)对后续PCR反应的影响。同时，只需加入两种溶液即可提取出较高质量的DNA，相较先加HCl溶液再加Tris缓冲溶液的碱性裂解方法，提取步骤和提取试剂明显减少；现有的碱裂解法均需在高温水浴中完成裂解细胞、提取DNA的过程，而本发明省去这个步骤，依靠碱性环境下研磨裂解，使细胞壁破碎，细胞膜变性，释放出基因组DNA。本发明建立的方法适用于农作物种子纯度、真实性、转基因成分快速检测及农作物关键性状分子标记辅助选择研究，特别是农作物单粒种子的高通量精准分析。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的方法获得的水稻DNA PCR扩增结果图；
图2为本发明实施例2提供的方法获得的玉米DNA PCR扩增结果图；
图3为本发明实施例3提供的方法获得的油菜DNA PCR扩增结果图；
图4为本发明实施例4提供的方法获得的辣椒DNA PCR扩增结果图；
图5为本发明实施例5和6提供的方法获得的小麦和大豆DNA PCR扩增结果图；
图中1～6孔为小麦DNA PCR扩增结果图；图中7～12孔为大豆DNA PCR扩增结果图；
图6为本发明对比实施例1提取的DNA PCR扩增结果图；
图7为本发明对比实施例2提取的DNA PCR扩增结果图；
图8为本发明对比实施例3提取的DNA PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，例如PCR反应，如无特殊说明，通常按照常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施提供的水稻品种DNA的提取过程如下：取单粒水稻种子浸种12～24h，置于发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天，长出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗样品和2粒钢珠。每孔加入NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液50μL，其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％，70Hz研磨90s，得到匀浆；加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，收集上清液，取1μL用于PCR反应。
选取适用于该品种纯度鉴定的SSR引物对该品种的24粒种子进行检测，结果如图1所示。图1表明，运用本发明方法提取的DNA质量完全满足PCR反应的需要。样品编号2、10、12、18、21为该品种中混入的亲本种子或其他品种种子，其余均为该杂交组合种子。检测样品的DNA扩增条带清晰，满足水稻种子纯度检测的需要。从实验过程可知，采用本发明建立的方法提取一批样品DNA平均只需1.5min，一个品种的纯度检测(200粒种子)可在2h内完成，该方法操作简单，高效便捷。
实施例2
本实施提供的玉米品种DNA的提取过程如下：取单粒玉米种子置发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天，长出根系0.5～1cm，取根系加入96孔板中，每孔1株根系样品和2粒钢珠。每孔加入NaOH溶液和NP40溶液的混合溶液50μL，其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，NP40溶液的体积浓度为1％，70Hz研磨90s，得到匀浆；加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，收集上清液，取1μL用于PCR反应。
选取适用于该玉米品种纯度鉴定的SSR引物对该品种的24粒种子进行检测，结果如图2所示。图2表明，提取的DNA质量完全满足PCR反应的要求。种子样品编号6、10、17、18、23为该品种中混入的亲本种子或其他品种种子，其余为该杂交组合种子。检测样品的DNA扩增条带清晰，DNA的质量满足玉米种子纯度检测的要求。采用本发明建立的方法省去了离心、沉淀、抽提等过程，具有高效、快速、经济、无污染的特点。
实施例3
本实施提供的油菜品种DNA的提取过程如下：油菜种子置发芽床上，15℃～25℃发芽5～7天，取同一品种50～100根0.5～1cm长的幼苗混合，与1粒钢珠一同加入2mL离心管中。每管加NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液500μL，其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％，60Hz研磨60s，得到匀浆；加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)500μL，收集上清液，取1μL提取的DNA用于PCR反应。
利用甘蓝型油菜品种鉴定SSR引物对两个油菜品种进行真实性检测，结果如图3所示。图3表明，两个品种在图中的12对SSR引物位点处表现不完全一致，在2和2’、9和9’两个位点处扩增结果存在明显差异。检测样品的DNA比对清晰，提取的DNA质量完全满足《NYT2468-2013甘蓝型油菜品种鉴定技术规程SRR分子标记法》的要求。采用本发明建立的方法提取一批样品的DNA平均只需1min，操作简单，经济省时，而且避免了有害试剂对人体健康及环境污染的影响。
实施例4
本实施提供的辣椒品种DNA的提取过程与实施例3的区别仅在于将油菜幼苗替换为辣椒幼叶，取1μL提取的DNA用于PCR反应。
利用辣椒品种鉴定SSR引物对两个辣椒品种进行真实性检测，结果如图4所示。图4表明，两个品种在图中的12对SSR引物位点处表现不完全一致，在12和12’引物位点处扩增结果存在明显差异。检测样品的DNA比对清晰，提取的DNA质量完全满足《NYT2475-2013辣椒品种鉴定技术规程SSR分子标记法》的要求。采用本发明建立的方法可在3h内将2个品种准确区分，该方法简单快捷、经济实用。
实施例5
本实施提供的小麦品种DNA的提取过程如下：小麦种子置发芽床上，20℃发芽4～8天；取同一品种50～100根0.5～1cm长的幼苗混合，与1粒钢珠一同加入2mL离心管中。每管加NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液500μL(其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％)，60Hz研磨60s，得到匀浆；加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)500μL，收集上清液，取1μL提取的DNA用于PCR反应。
利用检测小麦内参基因(Waxy-D1基因)的SSR引物对提取的小麦DNA进行检测，结果如图5中1～6孔所示。图5表明，1～6孔为小麦Waxy-D1基因的扩增结果，扩增产物在100bp左右有清晰条带，符合Waxy-D1基因预期的扩增片段大小(101bp)；说明提取的DNA质量完全满足后续PCR反应的要求。采用本发明建立的方法操作简单，经济高效，安全环保。
实施例6
本实施提供的大豆品种DNA的提取过程与实施例5的区别仅在于将小麦幼苗替换为大豆幼苗，取1μL提取的DNA用于PCR反应。
利用检测大豆内参基因(Lectin基因)的SSR引物对提取的大豆DNA进行检测，结果如图5中7～12孔所示。图5表明，7～12孔为大豆Lectin基因的扩增结果，扩增产物在200bp左右有清晰条带，符合Lectin基因预期的扩增片段大小(210bp)，说明提取的DNA质量完全满足后续PCR反应的要求。采用本发明建立的方法操作简单，经济高效，安全环保。
对比实施例1
本实施提供的水稻品种DNA的提取过程如下：取单粒水稻种子浸种12～24h，置于发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天，长出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗样品和2粒钢珠。第1～6孔加入0.1mol/L的NaOH溶液50μL，第7～12孔加入NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液50μL(其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％)，70Hz研磨90s，得到匀浆；第1～12孔均加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，收集上清液，取1μL用于PCR反应。
选取适用于该品种纯度鉴定的SSR引物对该品种的12粒种子进行检测，结果如图6所示。图6表明，第1～6孔DNA扩增条带微不可见，仅第2孔有微弱的条带，无法判定该品种的纯度；第7～12孔DNA扩增条带清晰，说明碱性研磨裂解时加入TritonX-100溶液可以促进细胞破碎释放出基因组DNA，提取质量更高，提取效果更好。
对比实施例2
本实施提供的水稻品种DNA的提取过程如下：取单粒水稻种子浸种12～24h，置于发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天，长出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗样品和2粒钢珠。每孔加入NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液50μL(其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％)，70Hz研磨90s，得到匀浆；第1～6孔沸水中水浴1min后加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，第7～12孔不经水浴直接加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，收集上清液，取1μL用于PCR反应。
选取适用于该品种纯度鉴定的SSR引物对该品种的12粒种子进行检测，结果如图7所示。图7表明，第1～6孔DNA扩增条带比较清晰；第7～12孔DNA扩增条带非常清晰，说明不需水浴所提取的DNA质量完全满足水稻种子纯度检测的需要。
对比实施例3
本实施提供的水稻品种DNA的提取过程如下：取单粒水稻种子浸种12～24h，置于发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天，长出幼苗0.5～1cm，取幼苗加入96孔板中，每孔1株幼苗样品和2粒钢珠。每孔加入NaOH溶液和TritonX-100溶液的混合溶液50μL(其中NaOH溶液的浓度为0.1mol/L，TritonX-100溶液的体积浓度为1％)，70Hz研磨90s，得到匀浆；第1～6孔加入0.05mol/L的HCl溶液50μL中和NaOH溶液，第7～12孔加入0.1mol/L Tris溶液(pH值为8.0)50μL，收集上清液，取1μL用于PCR反应。
选取适用于该品种纯度鉴定的SSR引物对该品种的12粒种子进行检测，结果如图8所示。图8表明，第1～6孔DNA扩增条带大部分比较清晰，但有些孔(第2、3孔)比较模糊，不利于纯度结果的判定；第7～12孔DNA扩增条带非常清晰，说明碱性裂解后加入Tris缓冲溶液，可以调整提取的DNA溶液pH值，有利于后续的PCR反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高效快速提取农作物基因组DNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)取农作物单粒种子发芽后长出的根系、幼苗或叶片于容器中，加入碱性溶液和钢珠后进行研磨，得到均浆；
2)向步骤1)所得裂解液中加入Tris缓冲溶液后收集上层清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农作物为水稻、玉米、小麦、大豆、油菜、辣椒和西瓜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述农作物单粒种子发芽后长出的根系、幼苗或叶片的获取方法如下：
1)水稻：种子浸种12～24h，置发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天即可；
2)玉米：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽4～7天即可；
3)小麦：种子置发芽床上，20℃发芽4～8天即可；
4)大豆：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽5～8天即可；
5)油菜：种子置发芽床上，15℃～25℃发芽5～7天即可；
6)辣椒：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽7～14天即可；
7)西瓜：种子置发芽床上，20℃～30℃发芽5～14天即可。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性溶液为NaOH溶液和Triton X-100溶液的混合溶液或NaOH溶液和NP40溶液的混合溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述Triton X-100溶液的体积浓度为0.5％～1.5％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中，所述NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述NP40溶液的体积浓度为0.5％～1.5％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述研磨的强度为60～70Hz，研磨的时间为60～90s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性溶液和Tris缓冲溶液的体积比为1:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris缓冲溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述Tris缓冲溶液的pH值为8.0～10.0。
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