CN113151568A - 一种辣椒辣椒素含量紧密连锁snp位点、其caps分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点、其CAPS分子标记及其应用，所述SNP位点为辣椒6号染色体上的第22748122位，其多态性为C/G；针对上述辣椒素含量紧密连锁SNP位点，本发明还提供了相应的CAPS分子标记、特异引物对、利用CAPS分子标记鉴定高辣椒素含量的辣椒品种的方法，该方法基于上述SNP位点的特征及酶切位点的应用，结合基因扩增和酶切方法，进一步地提高了高辣椒素含量的辣椒品种的鉴定效率，且准确率高，该CAPS标记的开发对于高辣椒素含量辣椒品种的培育具有重要意义。

Description

一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点、其CAPS分子标记及其 应用

技术领域

本发明涉及辣椒遗传育种和分子生物学领域，尤其涉及一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点、其CAPS分子标记及其应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)，别名牛角椒、长辣椒、菜椒、灯笼椒；为茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物。茎近无毛或微生柔毛，分枝稍之字形折曲。单叶互生，全缘或浅波状。花单生，双生或簇生于分枝处，俯垂或直立；花萼杯状，有5～7小齿；花冠白色，裂片卵形。果梗较粗壮，俯垂；果实俯垂或直立，果实形状多样，有灯笼型、羊角型、线型、指型等。青熟果多呈绿色或浅绿色，成熟后呈红色、黄色、橙色等。

辣椒与其他蔬菜最大的不同就是它的辣味，是深受人们喜爱的调味品，在我国的食用历史已有上百年。辣椒的营养价值很高，辣椒具有丰富的膳食纤维，其果实中维生素C含量在蔬菜中占首位。

辣椒素是辣椒形成辣味的主要成分，约占辣椒干重的0.1％～1％，是辣椒中加工和应用最多的营养成分，其提取的纯品可作为食品添加剂，此外辣椒素是催泪弹的重要原料，也可作为船舶防污涂料。多数研究表明辣椒素含量在辣椒中呈现出数量性状遗传。

传统农作物育种的效率低、工作量大、耗时长，分子标记辅助育种基于基因型筛选种质资源，避免或降低表型选择的误差，能大大提高育种效率。目前分子标记辅助育种已广泛应用于各种农作物育种中。

由于控制辣椒素含量的遗传位点较多且遗传比较复杂，目前还未研发出可高效、准确鉴定高辣椒素辣椒品系的SNP位点及相应的CAPS分子标记，因此，现有技术有待进一步的改进。

发明内容

为解决上述问题，本发明基于311份的一年生辣椒材料的辣椒素含量进行全基因组关联分析，找到了位于6号染色体上与控制辣椒素含量显著相关的SNP位点(SNP 6:22748122)，并根据该SNP位点设计了相关CAPS分子标记及其扩增引物，从而提供了一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点、其CAPS分子标记、其在鉴定高辣椒素含量的辣椒品种中的应用以及鉴定方法，该鉴定方法的准确率高，效率快。

本发明的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点，所述SNP位点为辣椒6号染色体上的第22748122位，其多态性为C/G。

第二方面，本发明提供一种如上所述的辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点在鉴定高辣椒素含量的辣椒品种中的应用。

第三方面，本发明还提供一种辣椒椒素含量紧密连锁的特异性CAPS分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的第227位多态性为C/G。

第四方面，本发明还提供一种用于检测上述的特异性CAPS分子标记的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

第五方面，本发明还提供一种如上所述的特异性CAPS分子标记在鉴定高辣椒素含量的辣椒品种中的应用。

第六方面，本发明还提供一种基于CAPS分子标记鉴定高辣椒素含量的辣椒品种的方法，其包括以下步骤：

S1.提取辣椒样本的基因组DNA；

S2.利用前述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将扩增得到的PCR产物经AluI酶切后电泳；

S4.结果判断：若酶切产物电泳得到226bp和290bp的电泳条带，则该样品的SNP位点的基因型为C：C，该样品为低辣椒素辣椒；

若酶切产物电泳得到516bp的电泳条带，则该样品的SNP位点的基因型为G：G，该样品为高辣椒素辣椒。

优选地，所述方法中，PCR扩增反应体系为：基因组模板2ul(浓度为50～200ng/ul)，2×Rapid Taq Master Mix 10ul，浓度为10μM/L的上游引物1ul、浓度为10μM/L的下游引物1ul，ddH₂O补足至20ul。

优选地，所述方法中，PCR扩增条件为：

Step1：95℃预变性4min；

Step2：95℃变性30s；

Step3：55℃退火30s；

Step4：72℃延伸45s；

Step5：重复Step2-4，进行32cycles，进行32cycles；

Step6：72℃延伸5min。

上述PCR扩增效率高，杂带少，较为优化。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种新的辣椒素含量紧密连锁SNP位点，其位于第6号染色体上的第22748122位，其多态性为C/G；通过鉴定该位点，可准确识别未知辣椒样本是否为高辣椒素植株，并可进行批量鉴定，极大地提高了鉴定效率和准确率。

2、针对上述辣椒素含量紧密连锁SNP位点，本发明还提供了相应的CAPS分子标记、特异引物、利用CAPS分子标记鉴定高辣椒素含量的辣椒品种的方法，该方法基于上述SNP位点的特征及酶切位点的应用，结合PCR扩增和酶切方法，进一步地大幅度提高了高辣椒素含量的辣椒品种的鉴定效率，且准确率达到100％，该CAPS标记的开发对于高辣椒素含量辣椒品种的培育具有重要意义。

附图说明

图1为辣椒素含量全基因组关联分析曼哈顿图；

图2为采用辣椒素CAPS引物对26份辣椒材料进行PCR扩增后的琼脂糖电泳结果，每材料两个重复；M为D2000 Marker，其他泳道为各个材料的PCR扩增产物，PCR扩增产物长度为516bp；

图3为PCR产物经限制性内切酶AluI酶切后的琼脂糖电泳结果；M为D2000 Marker，其他泳道分别为不同样品的PCR产物的酶切结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点的开发和确认

1、辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点的获得

对311份的一年生辣椒(Capsicum annuum L.)重测序，测序平台为IlluminaSolexa，采用Trimmomatic v0.33处理原始数据，去除接头、poly-N和低质量片段，得到clean data，利用BWA0.75将clean data比对到Zunla-1基因组数据(Qin et al.，2014)，设置参数为aln-o 1-e 10-t 4-l 32-i 15-q 10；利用Samtools 0.1.19(Li etal.，2009)，采用Bayesian算法，设置参数-q 1 -C50-S-D-m 2-F 0.002-u，运行命令mpileup，查找SNP，过滤SNP，设置最小基因等位频率大于0.01，缺失率小于0.1。

对311份一年生辣椒(Capsicum annuum L.)果实去除种子和果柄后，55℃-60℃烘干，用粉碎机研磨成粉末，采用超高效液相色谱(UPLC)测定辣椒素含量，辣椒素提取和测定方法参照农业行业标准(NY/T 1381-2007)。

具体方法如下：每次测定时，用25mL甲醇-四氢呋喃(1：1)(HPLC级；Sigma，USA)溶液提取0.2g(精确至0.0001g)样品粉末，在60℃水浴条件下，摇动在超声提取器中提取30分钟，然后过滤，收集滤液。将滤渣和滤纸通过超声提取器用25mL的甲醇-四氢呋喃溶液再萃取10分钟，然后过滤，收集滤液，再重复上述操作。将三次收集的滤液合并在一起，在旋转蒸发仪(70-75℃水浴)上将滤液浓缩至约30mL，然后将其转移至50mL容量瓶中，并用甲醇定容。

接着，通过0.22μm的有机相滤膜过滤后，进行色谱分析。根据样品中辣椒素和二氢辣椒素的含量，必要时进行稀释，使待测溶液中辣椒素的含量在0.13mg/L～160mg/L之间，二氢辣椒素的含量在0.04mg/L～160mg/L之间。

将滤液注入UPLC系统，该系统色谱柱是ACQUITY UPLC BEH的C₁₈ 2.1*100mm，粒径1.7μm(Waters UPLC,美国)，具有光电二极管阵列检测器的(Waters UPLC，美国)中。甲醇和蒸馏水(70:30)的混合物为流动相。流速为0.20mL/min。进样量为2μL，柱温箱为30℃。检测波长为280nm，辣椒素的保留时间为3.276min，二氢辣椒素的保留时间为4.395min。以200mg/L的纯甲醇储备液形式制备辣椒素和二氢辣椒素外标(Sigma，美国)。将储备溶液用甲醇稀释成一系列标准工作溶液，分别为100mg/L，50mg/L，20mg/L，10mg/L，1mg/L，0.2mg/L，并在上述条件下进行液相色谱测定。

以辣椒素和二氢辣椒素的浓度为纵坐标，相应的峰面积积分为横坐标，计算出标准曲线和线性回归方程。测量制备的测试溶液后，在多个点进行校准，并通过峰面积积分值进行定量。最后，将辣椒素和二氢辣椒素的含量换算成毫克每千克，其加和为总辣椒素含量。

接着，对上述过滤得到的SNP与辣椒素含量数据进行全基因组关联分析，全基因组关联分析采用Gemma中的线型混合模型，结果如图1所示，在6号染色体有显著相关信号，其中P值最高点位于物理位置22748122bp处(SNP：C/G)，与辣椒素含量显著相关，参考基因组碱基为C，突变碱基为G。该位点P值为7.97E-16(P值是GWAS分析中一个指标，表示SNP和性状变异的关联程度)。因此，得到辣椒素辣椒素含量紧密连锁SNP位点为6号染色体上的第22748122bp的位置。

2、对获得的SNP位点与辣椒素含量的关联性的确认

统计183份材料的辣椒素含量及该SNP位点的碱基类型，发现此位点基因型与辣椒素含量高低显著相关。当辣椒素含量以1200mg/kg为阈值时，小于1200mg/kg的材料共计169份，其中167份材料该位点基因型为C:C；大于1200mg/kg的14份材料的基因型均为G:G。

实施例2辣椒椒素含量紧密连锁的CAPS分子标记的开发

1、CAPS引物的设计

根据实施例1提供的SNP位点设计CAPS引物，前引物为CA-capsF：AAAAGGGTTCTAATTCGCGGC(见SEQ ID NO:2)，后引物为CA-capsR：GGAACTCTGGCTTGCAGGAT(见SEQ ID NO:3)，PCR扩增产物为516bp，其序列见序列表中SEQ ID NO:1，序列的第227位的S为G/C，为多态性位点。

2、样品基因组DNA的提取及PCR扩增

选取26份辣椒材料的幼嫩叶片进行基因组DNA提取用于后续实验，其包括15份低辣椒素材料(辣椒素含量低于1200mg/kg，基因型为CC)，11份高辣椒素材料(辣椒素含量高于1200mg/kg，基因型为GG)。每份材料取2株进行平行试验，DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.NucleicAcids Res 8:4321-4325。

(1)实验方法：

以上一步提取的26份样品的基因组为模板，按照以下条件构建PCR反应体系(20ul)：

模板	2ul
		2×Rapid Taq Master Mix	10ul
上游引物(10μM/L)	1ul
		下游引物(10μM/L)	1ul
ddH<sub>2</sub>O	6ul

PCR扩增程序如下：

Step1：95℃预变性4min；

Step2：95℃变性30s；

Step3：55℃退火30s；

Step4：72℃延伸45s；

Step5：重复Step2-4，进行32cycles；

Step6：72℃延伸5min。

扩增结束后，将扩增产物置于10℃条件下进行保存。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示，结果说明，所有样品的PCR扩增正常，都得到了516bp的扩增产物。

3、酶切

(1)实验方法：

对上个步骤得到的PCR产物利用限制性内切酶AluI进行酶切，酶切条件为：37℃，酶切1h；酶切体系(15ul)如下：

PCR产物	15uL
		AluI	0.5uL
Cut smart Buffer	1.5uL
		ddH<sub>2</sub>O	3uL

对上述酶切产物进行凝胶电泳，结果如图3所示。

(2)结果分析

对PCR后产物利用AluI进行酶切后出现两种结果：一种情况是SNP位点为参考基因组类型，即其基因型为C：C时，可以酶切开，酶切产物分别为226bp和290bp；另一种情况是SNP位点为变异类型碱基，即其基因型为G：G时，不能酶切开，产物长度仍为516bp。可根据PCR产物酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳，通过对酶切产物的片段长度和数量的差异，可明显区分开样品的辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点的基因型，从而鉴定该样品是否为高辣椒素含量辣椒品种。

从图3的结果可知，15份低辣椒素材料的电泳结果是双条带，可以酶切开，(酶切产物分别为226bp和290bp)，基因型应为C：C，与实际情况相符；11份高辣椒素材料的电泳结果是单条带，无法酶切开(产物长度仍为516bp)，基因型为G：G，也与实际基因型和高辣椒素表型相符。

由此可见，本发明针对此位点所设计的分子标记可有效用于不同辣椒素含量辣椒材料的分子鉴定，其准确率为100％，该CAPS标记的开发对于高辣椒素含量辣椒品种的培育具有重要意义。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点、其CAPS分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> CAPS分子标记序列( CAPS Molecular marker sequence)

<400> 1

aaaagggttc taattcgcgg ctttttgtgt cgcagagcat ttaaaactca agatgtgcca 60

agttctttaa ccagatctgc gcctgaattc tgctcaatct atgccatagc aaggggaaaa 120

gttctaaaac tcaagtcagc aagtcaacct gccagtccta gaagtaaaac aaactccaac 180

caatcatctc aaacaggatc ctcacatgat tccccagttt ctcaagstct tattccgtaa 240

gtctatccac aaaacctccc atggttgatg aaagtaaggc ccatcatggt tctaatttac 300

ggtgtagagg ataagactct ttttgattat tagtccagaa gattattttt cgttcatgta 360

tgtcggaaca tcttacttca tgattttaat gcacaatttt ccagccaggg aagttgggga 420

agtataggga actttgtgtc tattgatgct ggcagacgga gcatatcatc tgattgtagc 480

agttcctcgg ataggcatcc tgcaagccag agttcc 516

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 2

aaaagggttc taattcgcgg c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 3

ggaactctgg cttgcaggat 20

Claims (8)

1.一种辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为辣椒6号染色体上的第22748122位，其多态性为C/G。

2.一种如权利要求1所述的辣椒辣椒素含量紧密连锁SNP位点在鉴定高辣椒素含量的辣椒品种中的应用。

3.一种辣椒椒素含量紧密连锁的特异性CAPS分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的第227位多态性为C/G。

4.一种用于检测如权利要求2所述的特异性CAPS分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

5.一种如权利要求2所述的特异性CAPS分子标记在鉴定高辣椒素含量的辣椒品种中的应用。

6.一种基于CAPS分子标记鉴定高辣椒素含量的辣椒品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取辣椒样本的基因组DNA；

S2.利用权利要求4所述的引物对对提取的基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将扩增得到的PCR产物经AluI酶切后电泳；

S4.结果判断：若酶切产物电泳得到226bp和290bp的电泳条带，则该样品的SNP位点的基因型为C：C，该样品为低辣椒素辣椒；

若酶切产物电泳得到516bp的电泳条带，则该样品的SNP位点的基因型为G：G，该样品为高辣椒素辣椒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：基因组模板2ul，2×Rapid Taq Master Mix 10ul，浓度为10μM/L的上游引物1ul、浓度为10μM/L的下游引物1ul，ddH₂O补足至20ul。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其PCR扩增条件为：

Step1：95℃预变性4min；

Step2：95℃变性30s；

Step3：55℃退火30s；

Step4：72℃延伸45s；

Step5：重复Step2-4，进行32cycles；

Step6：72℃延伸5min。

Images