CN114686475A - 一种简易快速克隆植物基因的原位pcr技术 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种基于原位PCR技术简便、快捷克隆植物基因的方法。本发明基于原位PCR技术，采用碱溶液与表面活性剂混合作为裂解液，比较了两种碱溶液和三种表面活性剂的裂解效果，从中选出了一种最佳的裂解液条件。相比传统PCR技术通过CTAB法和SDS法的繁琐步骤去除细胞内蛋白、多糖、RNA、盐类等杂质，提纯DNA或RNA进行扩增，程序复杂、耗时长，每次提取DNA时都需要大量实验材料与接触有害试剂，无法减少耗材与人力资源，且在提取过程中会造成DNA的损伤。本研究所用的方法无需提DNA或RNA，使用少量烟草叶片与常见实验试剂，即可短时高效裂解烟草叶片内表面细胞壁，使DNA分子裸露，为分子生物学提供了简便、快捷的提取方法，更为经济、高效。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种简易快速克隆植物基因的原位PCR技术。
背景技术
原位PCR技术是指结合了传统PCR技术和原位杂交技术的原位多聚酶链式反应技术，兼有二者的优点，该实验技术可以在保持组织细胞形态结构的基础上，增加细胞膜的通透性，以细胞膜作为反应场所，通过前处理使得PCR体系中的引物、探针、酶系、游离核苷酸等进入核膜，与暴露的拟扩增目的DNA或RNA进行PCR反应，且具有较高的敏感性，可以检测出组织或细胞内的微量DNA或RNA并进行大量扩增，又可揭示出扩增的目的片段与目的组织之间的形态结构关系，具有良好的组织定位的能力。
随着原位PCR技术的广泛运用，该实验技术也在动植物方面受到人们的重视与不断完善，与此同时研究方法有着相应的提高，不同的反应条件也会影响该实验技术的成败，应根据不同的实验材料、不同类型的标本等各种因素，优化出适宜的原位PCR的实验体系，才能获得理想的结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于原位PCR技术简便、快捷克隆植物基因方法。
本发明基于原位PCR技术，采用碱溶液与表面活性剂混合作为裂解液，比较了两种碱溶液和三种表面活性剂的裂解效果，从中选出了一种最佳的裂解液条件。相比传统PCR技术通过CTAB法和SDS法的繁琐步骤去除细胞内蛋白、多糖、RNA、盐类等杂质，提纯DNA或RNA进行扩增，程序复杂、耗时长，每次提取DNA时都需要大量实验材料与接触有害试剂，无法减少耗材与人力资源，且在提取过程中会造成DNA的损伤。本研究所用的方法无需提DNA或RNA，使用少量烟草叶片与常见实验试剂，即可短时高效裂解烟草叶片内表面细胞壁，使DNA分子裸露，为分子生物学提供了简便、快捷的提取方法，更为经济、高效。
为此本发明的技术方案如下：种基于原位PCR技术简便、快捷提取植物叶片内DNA或RNA方法，其特征是，将采集的植物叶片碾磨并浸泡于A液中，短暂离心后在PCR仪上95℃保持15min，取出加入等体积的B液，混匀后即可作PCR反应体系的模板。
其中A液为：50μL 1mol/L KOH溶液(或NaOH溶液)，置于1.5mL Eppendorf管中，然后加入100μL 10％Triton X-100溶液，加入850μL一级超纯水补足终体积至1000μL。B液：50μL含0.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)和2mmol/L EDTA混合的TE中和液。
附图说明
图1为碱溶液优化PCR体系电泳图；
图2为表面活性剂优化PCR体系电泳图；
具体实施方式
下面以烟草的叶片作为试验材料详细说明制备方法。
实施例1
碱溶液对烟草叶片DNA的提取的影响
1烟草叶片DNA的提取
1)50μL 1.5mol/L KOH溶液，置于1.5mL Eppendorf管中，然后加入100μL 10％Triton X-100溶液，加入850μL灭菌双蒸水补足终体积至1000μL；
2)用一次性刀片切取烟草的鲜嫩叶片约20mm2(4mm×5mm)，用灭菌过的剪刀剪碎并置于0.2mL的PCR薄壁管中，向其中加入50μL裂解液，使叶片充分浸泡在裂解液中，经过短暂离心后，在PCR仪上95℃保持15min，使其皂化，裂解破碎细胞；
3)取出PCR薄壁管置于冰上，加入50μL含0.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)和2mmol/LEDTA混合的TE中和液，混匀，可直接用作PCR反应模板。
实施例2
表面活性剂对烟草叶片DNA的提取的影响
1烟草叶片DNA的提取
2)50μL 1.5mol/L KOH溶液，置于1.5mL Eppendorf管中，然后加入100μL 6％Triton X-100溶液，加入850μL灭菌双蒸水补足终体积至1000μL；
4)用一次性刀片切取烟草的鲜嫩叶片约20mm2(4mm×5mm)，用灭菌过的剪刀剪碎并置于0.2mL的PCR薄壁管中，向其中加入50μL裂解液，使叶片充分浸泡在裂解液中，经过短暂离心后，在PCR仪上95℃保持15min，使其皂化，裂解破碎细胞；
5)取出PCR薄壁管置于冰上，加入50μL含0.5mol/L Tris-HCl(pH 8.0)和2mmol/LEDTA混合的TE中和液，混匀，可直接用作PCR反应模板。
本实验PCR扩增
1)PCR体系：5μLDNA模板+12.5μLTaq PCR Master Mix+0.5μL上游引物+0.5μL下游引物+6.5μLddH2O
2)反应程序为：94℃，3min总变性后，以下设置步骤进行30个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，循环反应结束后再在72℃总延伸8min，扩增产物保存于4℃冰箱。
3)引物见表1。
表1 PCR引物设计
3结果检测
制得一块含琼脂糖浓度0.7％、GenGreen核酸染液2μL的凝胶，取4μLDNA MarkerIII作为标准分子量对照，用移液枪吸取PCR扩增产物各10μL，依次在加样口点样，设置电泳仪电压120V，电泳时间30min，254nm紫外灯下观察并拍照记录，见图1、2。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (2)
1.一种裂解液表面活性剂，Triton X-100，其特征在于是一种比较温和的去垢剂，用作裂解液时可以提高真核细胞细胞膜的通透性。
2.一种是表面活性剂Triton X-100的浓度范围，在0％-15％。
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| 徐宗昌等: ""烟草碱法提取基因组DNA的改进"", 《生物技术通报》, vol. 33, no. 02, pages 59 - 65 * |
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