CN110643603A - 一种简单快速提取谷子微量dna的方法及应用 - Google Patents

一种简单快速提取谷子微量dna的方法及应用 Download PDF

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王素英
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魏萌涵
付楠
宋中强
宋慧
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Abstract

本发明公开了一种简单快速提取谷子微量DNA的方法及应用，方法包括如下步骤：（1）取新鲜干净的谷子叶片直接至PCR排管中；（2）加入溶液A，溶液A的组分为：100mM NaOH和2%Tween 20；（3）95℃水浴10‑15min或直接放置于PCR仪中95℃加热10‑15min；（4）加入溶液B，溶液B的组分为：100mM Tris‑HCL和2mM EDTA，pH=8.0；（5）将加入的溶液上下颠倒数次后混匀，不要剧烈震荡，离心后即得到DNA溶液。本方法所需样品量少，不需要昂贵的仪器，不使用毒性试剂，操作简便，省工省时，环保安全，适用于大批量快速提取基因组微量DNA；本方法可用于对谷子杂交种后代真假杂交的鉴定。

Description

一种简单快速提取谷子微量DNA的方法及应用
技术领域
本发明具体涉及一种利用少量谷子叶片组织大批量快速提取谷子基因组微量DNA的方法，属于农业生物技术与分子生物学领域。
背景技术
谷子（Setaria italica）禾本科，古称稷或粟，去壳后为小米，是世界范围内最古老的作物之一，在我国的栽培历史可追溯到11500年前。谷子是起源于我国黄河流域的粮饲兼用作物，在中华民族发展的历史长河中曾占有重要的地位，直至新中国成立初期，谷子仍然是我国主要栽培作物之一。利用现代生物技术手段对谷子种质资源进行分子遗传育种及品种改良工程等均离不开对谷子DNA的提取操作。
DNA是分子生物学主要的研究对象之一，如何简便、快速的提取基因组DNA在很大程度上影响着整个生物实验的进程。随着生物技术的快速发展，各种农作物的全基因组测序不断完成，基于PCR技术的分子生物技术，如分子标记辅助育种、QTLs定位、品种检测、转基因植物检测等开始被广泛的应用到实际生产之中。DNA的提取是最基本的步骤，在进行大样本筛选时工作量极大，现有的DNA提取方法，如CTAB法、苯酚法、SDS法等，都存在操作繁杂、费时费力、试剂昂贵、容易产生环境污染、有毒试剂危害操作者健康等诸多缺点。
例如目前对谷子DNA提取常用的方法主要还是SDS法，CTAB法，磁珠法等，但这些方法存在样品前期处理复杂，步骤多，操作时间长，使用有毒化学试剂多，有些方法还要附加RNA酶、DTT等价格昂贵的试剂，而且所需组织样品量多等缺点，不仅耗时长、成本高，而且含有对操作者身体有害的试剂。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种简单快速提取谷子微量DNA的方法，可解决传统提取方法的耗时长、成本高、试剂有毒有害等问题。
本发明的技术方案为：一种简单快速提取谷子微量DNA的方法，包括如下步骤：
（1）取新鲜干净的谷子叶片直接至PCR排管中；
（2）加入溶液A，溶液A的组分为：100mM NaOH和2% Tween 20
（3）95℃水浴10-15min或直接放置于PCR仪中95℃加热10-15min；
（4）加入溶液B，溶液B的组分为：100mM Tris-HCL和2mM EDTA，pH=8.0；
（5）将加入的溶液上下颠倒数次后混匀，不要剧烈震荡，离心后即得到DNA溶液。
进一步的，所述步骤（1）中谷子叶片面积为30mm2，步骤（2）的溶液A和步骤（3）中的溶液B的体积均为50µL。
进一步的，利用上述提取谷子DNA溶液的方法，可用于对谷子杂交后代的真假杂交种的鉴定，谷子真假杂交种的鉴定步骤如下：
（1）取1个父本、1个母本以及若干个杂交种的谷子叶片，利用上述方法提取各自DNA溶液；
（2）以提取的各个样本DNA为模板，分别利用引物1和引物2，进行PCR扩增，采用20µlPCR体系：DNA template 2.0µL，10×Taq Buffer 2.0µL，dNTPs Mixture(2.5mM) 0.5µL，Taq Polymerase(2.5U/μL ) 0.5µL，Primer pair (10 mM ) 1.0µL，dd water 7.3µL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，变性-退火-延伸共进行35个循环，最后72℃延伸5min；
引物1序列：Primer1F：CCTTCAACCTGACTTTGCAC，Primer1R：CATGACAAGGATCGTCACAG；
引物2序列：Primer2F：GAGCGTTCCATGAAAGCAAG，Primer2R：ACAAGATCGACCGAGAGGTT；
（3）对上述各个样本的扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳图中同时具有父本和母本双亲特异条带特征的即为真杂交种。
本发明只采用实验室中常用的几种试剂，对人体和环境都相对友好，环保安全；且不需要使用昂贵的仪器；样品处理简单且样品量少；操作步骤简单、省时省工，从取样到DNA提取可在30min内完成，并且可同时进行多个甚至大量样品的DNA提取，因此是一种简单快速、经济环保且可进行大批量操作的微量DNA提取方法，所提取的DNA可直接用于真假杂交种鉴定、分子标记、指纹图谱等分子生物学实验。
附图说明
图1为采用引物1进行PCR扩增产物的电泳图。
图2为采用引物2扩增PCR扩增产物的电泳图。
图中：M为标记物，序号1为豫谷18，序号2为冀谷19，序号3-10分别为8个杂交后代。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做更详细的说明。
一种简单快速提取谷子微量DNA的方法，具体步骤如下：
1、取新鲜干净的谷子叶片30mm2左右直接至于200µl PCR排管中；
2、加入50µl 溶液A （100mM NaOH；2% Tween 20）；其中NaOH作为碱性裂解液，用来裂解组织细胞，破坏叶片组织细胞壁，释放遗传物质；吐温20作为表面活性剂，提高溶液与叶片的结合能力；
3、95℃水浴10-15min或直接放置于PCR中95℃加热10-15min；加热有助于更快、更多的释放遗传物质；
4、加入 50µl 溶液B（100mM Tris-HCL；2mM EDTA，pH=8.0）；其中Tris-HCL作为缓冲液，用来调节DNA溶液pH值；EDTA作为DNA酶抑制剂用来抑制DNA降解；
5、将加入溶液混匀(上下颠倒数次后离心即可，不要剧烈震荡)，即得到DNA溶液;；
其中溶液A和B 的配置方法如下：
1L溶液A配置方法：0.8g NaOH，4ml Tween 20 定容至1L；
1L溶液B配置方法：60.55g tris-HCl，0.584g EDTA定容至1L。
实施例：豫谷18和冀谷19杂交后代真假杂交种的检测
1、取新鲜干净的叶片1cm，用锡箔纸包好待用；
2、每个样品剪取30mm2左右的叶片，放置于200µl PCR排管中（编号分别为1-10，其中1为豫谷18，2为冀谷19，3-10分别为8个杂交后代）；
3、向每个样品中加入50µl 溶液A；
4、将加入溶液A的样品至于PCR仪，设置95℃，15min；
5、将PCR仪中样品取出，加入溶液B；
6、上下颠倒混匀，静置待用，即得到DNA溶液；
7、以上述各个样品溶液DNA为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增，采用20µl PCR体系：
Figure 355618DEST_PATH_IMAGE001
PCR扩增程序：
其中两对引物的序列如下：
Primer1F：CCTTCAACCTGACTTTGCAC
Primer1R：CATGACAAGGATCGTCACAG
Primer2F：GAGCGTTCCATGAAAGCAAG
Primer2R：ACAAGATCGACCGAGAGGTT
8、电泳检测
采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1和图2。由两对引物的电泳图可知，在这8个后代中，编号为9的单株为真杂交种，其他为假杂交种。

Claims (3)

1.一种简单快速提取谷子微量DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取新鲜干净的谷子叶片直接至PCR排管中；
（2）加入溶液A，溶液A的组分为：100mM NaOH和2% Tween 20；
（3）95℃水浴10-15min或直接放置于PCR仪中95℃加热10-15min；
（4）加入溶液B，溶液B的组分为：100mM Tris-HCL和2mM EDTA，pH=8.0；
（5）将加入的溶液上下颠倒数次后混匀，离心后即得到DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的一种简单快速提取谷子微量DNA的方法，其特征在于：所述步骤（1）中谷子叶片面积为30mm2，步骤（2）中的溶液A和步骤（3）中的溶液B的体积均为50µL。
3.一种鉴别谷子杂交后代真假杂交种的方法，其特征在于：鉴定步骤如下：
（1）取1个父本、1个母本以及若干个杂交种的谷子叶片作为样本，利用权利要求1所述方法提取各个样本谷子的DNA溶液；
（2）以提取的各个样本DNA为模板，分别利用引物1和引物2，进行PCR扩增，采用20µlPCR体系：DNA template 2.0µL，10×Taq Buffer 2.0µL，dNTPs Mixture(2.5mM) 0.5µL，Taq Polymerase(2.5U/μL ) 0.5µL，Primer pair (10 mM ) 1.0µL，dd water 7.3µL；
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，变性-退火-延伸共进行35个循环，最后72℃延伸5min；
引物1序列：Primer1F：CCTTCAACCTGACTTTGCAC，Primer1R：CATGACAAGGATCGTCACAG；
引物2序列：Primer2F：GAGCGTTCCATGAAAGCAAG，Primer2R：ACAAGATCGACCGAGAGGTT；
（3）对上述各个样本的扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在电泳图中同时具有父本和母本双亲特异条带特征的即为真杂交种。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104928396A (zh) * 2015-07-08 2015-09-23 山东省华盛农业股份有限公司 一种利用est-ssr分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法
CN108660237A (zh) * 2017-12-19 2018-10-16 深圳华大小米产业股份有限公司 一种与谷子株高基因紧密连锁的分子标记SIsv1099及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104928396A (zh) * 2015-07-08 2015-09-23 山东省华盛农业股份有限公司 一种利用est-ssr分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法
CN108660237A (zh) * 2017-12-19 2018-10-16 深圳华大小米产业股份有限公司 一种与谷子株高基因紧密连锁的分子标记SIsv1099及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邹克琴等: "《基因工程原理和技术》", 31 January 2009 *

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