CN107338246A - 番茄果实干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番茄果实干汁性状的特异性序列，该序列如SEQ ID NO：1所示，还提供了鉴定上述性状的方法与分子标记物，包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物，如SEQ ID NO：3所示的下游引物，也提供了鉴定上述性状的方法：(1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用所述分子标记物进行PCR扩增；(2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待鉴定番茄的PCR扩增产物含有如SEQ ID NO：1所示的DNA片段，则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄，反之则为干汁番茄。利用本发明进行番茄果实干汁性状的分子标记辅助选择，可提高选择效率，加快育种进程；本发明只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对样品的鉴别。
Description
技术领域
本发明属于遗传学与生物学技术领域，具体为番茄果实干汁性状特异性序列及其分子标记物与鉴定方法。
背景技术
番茄具有较高的营养价值和经济价值，是重要的鲜食产品和加工原料，已成为继玉米、水稻、小麦与马铃薯等之后的世界第七大作物，全球年工业产值可达500亿美元。番茄果实不仅含有对人体有益的碳水化合物、纤维素和矿质元素等，并且含有多种维生素，以及决定果实风味的多种糖、有机酸和挥发性有机化合物。番茄因其重要的农业价值、丰富的营养价值、优越的植物学特性和基础研究优势，成为研究肉质果特别是肉质浆果及其发育的模式植物，解释了众多果实的生理、发育和代谢等机理，如关于肉质果实的器官发生、发育和成熟，以及感官品质和营养的分子基础等。
利用不断发展的理论和技术，培育满足生产和市场需求的优良品种，是番茄育种的根本目的。随着遗传学的发展，遗传标记的得到广泛应用和推广，分为形态标记、细胞学标记、生化标记等表现型标记和DNA片段标记等基因型标记。DNA片段标记能够直接反映生物个体或种群间基因组的某种差异，具有不受环境和基因表达的影响，而且具有数量丰富，遗传稳定，操作简单等优点。从20世纪80年代后期开始，分子标记辅助选择技术和基因工程技术为核心的生物育种技术得到了快速的发展。常用的分子标记有基于Southern杂交的限制性片段长度多态性标记(RFLP)，基于PCR技术的DNA扩增方法的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，特定序列扩增标记(SCAR)和简单重复序列标记(SSR)，以及基于PCR与酶切相结合的扩增片段长度多态性标记(AFLP)、切割扩增的多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性(SNP)等。PCR是聚合酶链式反应的英文缩写(Polymerase Chain Reaction)，PCR反应可以扩增一个DNA片段。PCR技术已经被广泛用于生物学、分子生物学、生物化学、生物医学等学科。
心室胶状物是番茄等肉质浆果的典型特征，在果实的形成、发育、风味组成与质地变化等均发挥着重要作用。普通番茄成熟后，果实心室组织发育成凝胶状的心室胶状物(locular gel)。心室胶状物作为番茄果实中除果皮外的第二大丰富组织，是风味品质的重要构成因素。干汁番茄材料(all flesh，alf)果实不形成心室胶状物，果实仍能正常发育成熟，干汁番茄果实干物质含量高，可提高果实的耐贮运性，减缓番茄切片的降解速度，用于制干番茄及汉堡夹心等。干汁番茄材料的研究可为深入理解番茄风味品质的形成及遗传改良提供理论依据，并可为解析番茄果实心室胶状物的形成和发育的分子机制奠定基础。然而，现有技术中采用分子标记技术直接鉴定番茄是否为干汁番茄却鲜有报道。
发明内容
为解决现有技术中上述问题，本发明提供了番茄果实干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法，实现的目的为，提供一种在番茄苗期快速筛选和鉴定番茄果实干汁性状的方法和检测技术，可于植株早期快速稳定地筛选和鉴定番茄果实的干汁性状。
为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供了一种番茄果实干汁性状的特异性序列，该序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还公开了鉴定番茄果实干汁性状的分子标记物，该分子标记物包括上游引物、下游引物，上游引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：3。
鉴别番茄果实干汁性状的方法，包括如下步骤：检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID NO：1的DNA片段。
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID NO：1的DNA片段，所述待鉴定番茄为普通有汁番茄；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID NO：1的DNA片段，所述待鉴定番茄为干汁番茄。
采用上述特异性基因序列与分子物，鉴定番茄果实干汁性状的方法，包括如下步骤：(1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用所述分子标记物进行PCR扩增得到其扩增产物；
(2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果所述待鉴定番茄的PCR扩增产物含有如SEQ ID NO：1所示的DNA片段，则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄；反之则为干汁番茄。
所述步骤(1)中PCR反应温度程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸8min。
所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是：将引物对的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Goldview染色，缓冲液为0.5×TBE，4V·cm-1恒压下电泳40min，Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。
所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带仅显示358bp条带，则待鉴定番茄为干汁番茄。
所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带显示497bp条带或显示497bp与358bp两个条带，则待鉴定番茄为有汁番茄。
所述步骤(1)中扩增试剂盒包括：
所述待鉴定番茄的基因组DNA模板的质量浓度为25ng/μl，上游引物的质量浓度为50ng/μl，下游引物的质量浓度为50ng/μl，dNTPs混合物的浓度摩尔质量浓度为10mM，MgC12溶液的摩尔质量浓度为25mM，Taq DNA聚合酶的质量浓度为5U/μl，以上组成试剂盒的各成分质量浓度、摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质量浓度、摩尔浓度。
本发明的有益效果是：采用本发明成套引物对番茄育种群体进行辅助选择得到了干汁番茄株系，这表明本发明所述分子标记物用于番茄干汁性状的分子标记辅助选择是切实有效的，利用本发明进行分子标记辅助选择可提高选择效率，加快育种进程。
用此方法鉴别番茄果实否具有干汁性状，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对样品的鉴别。本方法不需要限制性内切酶酶切，具有经济、操作简单、特异性强、重复性好等优点。
附图说明
图1为采用本发明鉴定番茄果实干汁性状分子引物对的PCR产物的电泳结果，其中，
M为100bp DNA ladder，p1为母本IL7-5，p2为父本06790，F1为IL7-5×06-790的F1，其余为IL7-5×06-790的F2株系编号。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：本发明提供的一种番茄果实干汁性状的特异性序列，该序列如SEQ IDNO：1所示，鉴定该性状的分子标记物，包括上游引物、下游引物，上游引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明通过干汁番茄基因组重测序，获得了一批与干汁性状连锁的SNP位点和插入缺失序列，通过将这些位点和序列设计引物，进行遗传连锁分析与验证，从中筛选出一系列与干汁性状相连锁的分子标记，包括CAPS、dCAPS与PCR标记等。由于干汁番茄为隐性性状，所以选择共显性标记进行验证，其中包括CAPS-1、CAPS-2与dCAPS-1等。
CAPS-1：
正向引物：5’-TAGGCAAACTCTATTCATCAAGG-3’(CAPS1 No.1)
反向引物：5’-CTATGCTGTGGTAGGTAGACTTGC-3’(CAPS1 No.2)
PCR扩增后，用限制性内切酶MboI进行酶切，然后进行琼脂糖电泳，干汁番茄不能够被酶切，显示一个480bp条带。普通有汁番茄能够酶切或部分酶切，显示120bp和360bp两个条带，或显示120bp、360bp和480bp三个条带。
CAPS-2：
正向引物：5’-TGAGAAAAATAAGAATAGCCGATG-3’(CAPS2 No.1)
反向引物：5’-CACACATCAACCTCCAGACTCC-3’(CAPS2 No.2)
PCR扩增后，用限制性内切酶TaqI进行酶切，然后进行琼脂糖电泳，干汁番茄能够完全酶切，显示290bp和340bp两个条带。普通番茄不能够被酶切或不能够被完全酶切，显示一个630bp条带，或显示290bp、340bp和630bp三个条带。
dCAPS-1：
正向引物：5’-TTATGAAAACATTCGGTGGTGC-3’(dCAPS1 No.1)
反向引物：5’-ATAATTTGATGTTTAATTTAGCCAT-3’(dCAPS1 No.2)
PCR扩增后，用限制性内切酶BccI进行酶切，需要聚丙烯酰胺凝胶电泳，干汁番茄不能够被酶切，仅显示一个180bp条带。普通有汁番茄能够被酶切，由于20bp片段较小，多会电泳到凝胶外，不能够显示，因此显示160bp一个条带，或160bp和180bp两个条带。
dCAPS-2：
正向引物：5’-GAGATGTACATCATATACTTACATG-3’(dCAPS2 No.1)
反向引物：5’-TTGTTCGTGTATTCAAACGCTTAT-3’(dCAPS2 No.2)
PCR扩增后，用限制性内切酶AflIII进行酶切，需要聚丙烯酰胺凝胶电泳，干汁番茄能够被完全酶切，仅显示一个150bp条带。普通有汁番茄不能够被酶切或不能够被完全酶切，显示170bp一个条带，或150bp和170bp两个条带。
由于CAPS与dCAPS等引物PCR之后需要进行限制性内切酶酶切，耗时长，并且限制性内切酶价格较为昂贵，并由于酶切时间和温度等原因，可能造成酶切不够彻底，影响电泳条带判断的准确性，影响干汁性状选择和鉴定的准确性。
因此本发明选择不需要进行酶切的引物标记进行验证，而且本发明所公开的番茄果实干汁性状的特异性核苷酸序列、分子引物为鉴定番茄干汁性状最为准确，方法最为简便的核苷酸序列。
实施例二：本发明除了公开上述番茄果汁干汁性状的特异性序列、引物，还公开了鉴定番茄果实干汁性状的方法，包括如下步骤：
(1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用所述分子标记物进行PCR扩增得到其扩增产物；
(2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果待鉴定番茄的PCR扩增产物含有如SEQ ID NO：1所示的DNA片段，则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄，反之则为干汁番茄。
所述步骤(1)中PCR反应温度程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸8min。
所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是：将引物对的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Goldview染色，缓冲液为0.5×TBE，4V·cm-1恒压下电泳40min，Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。
所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳显示条带仅显示358bp条带，则待鉴定番茄为干汁番茄。
所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳显示条带显示497bp条带或显示497bp与358bp两个条带，则待鉴定番茄为有汁番茄。
所述步骤(1)中扩增试剂盒包括：
以上组成试剂盒的各成分质量浓度、摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质量浓度、摩尔浓度，各成分溶解于现有技术常用溶剂形成溶液后检测使用。
以下试验表明，本发明所提供的特异性核苷酸序列、设计的引物、鉴定方法为鉴定番茄干汁性状最为准确、有效、便捷，IL7-5×06790的F2株系是按照如下方法获得：IL7-5(作为母本)和06790(作为父本)杂交，得到F1，F1自交收获F1植株所结的种子获得F2的种子。随机取F2的种子进行种植，得到F2植株，取编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45。
(一)田间正常栽培管理，待番茄果实转色后，鉴定每株系的果实干汁性状，每株系调查10个果实，以确保鉴定结果的准确性。田间鉴定结果如表1所示，表明株系编号为15、35、36、42为干汁番茄；株系编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、43、44、45为普通有汁番茄。
(二)利用本发明方法鉴定番茄的干汁性状，在步骤(一)编号为1-45的株系、IL7-5(株系编号为p1)和06790(株系编号为p2)的番茄幼苗期分别采集番茄叶片提取其基因组DNA，分别以提取的各个株系的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增。
(三)田间成株期果实干汁性状鉴定
PCR反应完成后，将引物对的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Goldview染色，缓冲液为0.5×TBE，在4V·cm-1恒压下电泳40min，Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。其中，10×TBE(1L)的配制方法如下：Tris 108g，硼酸55g，EDTA 7.44g，用ddH2O定容至1L，使用前用蒸馏水配制成0.5×工作液，常温保存。引物对的PCR产物的电泳结果如图1所示，IL7-5(株系编号为p1)、06790(株系编号为p2)和编号为1-45的株系的PCR产物均得到特异条带。见表一所示。
表一
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120>番茄果汁干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法
<130>
<160>1
<170>Patentln version 3.3
<210>1
<211>139
<212>番茄果实干汁性状的特异性核苷酸序列
<213>
<220>
<223>
<400>1
AGGGTCCACC TTTTTCGTAC TCGCTGTTAC GGAGGCTGAC ACCGTCAGTT TCAACAAAGC 60
TGCAGGAATA GTCTATACCT TTTTTCTTAA CGTCGTTAGG GTTTGATTTT GGCTTTGACA 120
TGGCAGAGTA GAAAAGGAT 139
<210>2
<211>
<212>鉴定番茄果实干汁性状的上游引物
<213>
<220>
<223>
<400>2
5’-CCTACAAGAATACAAAGCCT-3’
<210>3
<211>
<212>鉴定番茄果实干汁性状的下游引物
<213>
<220>
<223>
<400>3
5’-GGATGGCTCTAATGACAATG-3’
Claims (7)
1.一种番茄果实干汁性状的特异性序列，其特征在于，该序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种鉴定番茄果实干汁性状的分子标记物，其特征在于，该分子标记物包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。
3.一种鉴定番茄果实干汁性状的方法，包括如下步骤：检测待鉴定番茄的基因组DNA中是否含有SEQ ID NO：1的DNA片段；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID NO：1的DNA片段，所述待鉴定番茄为普通有汁番茄；
如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID NO：1的DNA片段，所述待鉴定番茄为干汁番茄。
4.根据权利要求3所述鉴别番茄果实干汁性状的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板，用权利要求2所示核苷酸序列的分子标记物进行PCR扩增，得到其扩增产物；
(2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果所述待鉴定番茄的PCR扩增产物含有权利要求1如SEQ ID NO：1所示的DNA片段，则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄，反之则为干汁番茄；
所述步骤(1)中PCR反应温度程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸8min。
所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是：将引物对的PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Goldview染色，缓冲液为0.5×TBE，4V·cm-1恒压下电泳40min，Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。
5.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法，其特征在于，所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带仅显示358bp条带，则待鉴定番茄为干汁番茄。
6.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法，其特征在于，所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带显示497bp条带或显示497bp与358bp两个条带，则待鉴定番茄为有汁番茄。
7.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增试剂盒包括：
所述待鉴定番茄的基因组DNA模板的质量浓度为25ng/μl，上游引物的质量浓度为50ng/μl，下游引物的质量浓度为50ng/μl，dNTPs混合物的浓度摩尔质量浓度为10mM，MgC12溶液的摩尔质量浓度为25mM，Taq DNA聚合酶的质量浓度为5U/μl，以上组成试剂盒的各成分质量浓度、摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质量浓度、摩尔浓度。
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