CN107881253A - 大麦ssr引物组及利用该引物组构建啤酒大麦品种指纹图谱的方法 - Google Patents

大麦ssr引物组及利用该引物组构建啤酒大麦品种指纹图谱的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大麦SSR引物组及利用该引物组构建啤酒大麦品种指纹图谱的方法。本发明大麦SSR引物组包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。本发明通过大麦SSR引物组和啤酒大麦种子提取得到的DNA进行SSR‑PCR扩增反应，结合毛细管凝胶电泳检测，可构建得到啤酒大麦品种指纹图谱。本发明通过构建啤酒大麦品种指纹图谱，根据9对大麦SSR引物对不同大麦品种所得到的特异性位点之间的差异，可将不同品种的啤酒大麦全部分开，具有检测速度快、分离效率和灵敏度高、重复性好，多态性较高的优点，可满足口岸快速通关需要，具有良好的应用前景。

Description

大麦SSR引物组及利用该引物组构建啤酒大麦品种指纹图谱 的方法
技术领域
本发明属生物技术领域，更具体地说，本发明涉及利用SSR技术并结合毛细管电泳技术构建主要进口啤酒大麦品种的SSR指纹图谱的方法。
背景技术
啤酒大麦是啤酒生产的主要原料，大麦的质量直接影响啤酒的品质和口感；而大麦的质量受品种、产区、气候条件等因素的影响，大麦不同品种之间的淀粉、蛋白质、β-葡聚糖以及酶系活性等均存在一定差异，这些差异直接影响麦芽制造和啤酒酿造工艺。因此，大麦品种的真实性及纯度是啤酒酿造的关键。
目前，中国已成为世界上最大的啤酒生产国(刘慧，薛凤蕊.中国大麦贸易现状及发展趋势[J].农业贸易展望，2015,8:66-69.)。随着我国啤酒产量的不断增长，国产大麦产量及质量难以满足市场需求，啤酒大麦的进口量迅猛增长，位列进口谷物前3位，2013-2014年度进口量达到历史最高的489.1万t(李先德，孙志胜，张京.2014年世界和中国大麦与贸易形势及2015年展望[J].农业生产展望，2015,2:43-47.)。近年来，我国啤酒大麦主要进口国主要为澳大利亚、加拿大和法国；在国际贸易中，大麦品种是优质优价的，不同品种的价格相差数十美元/吨；一般情况下买卖双方会在贸易合同中对大麦品种以及品质指标等进行标注和规定，如澳大利亚的Gairdner、加拿大的Metcalfe、法国的Sebastian等等，如果进口的大麦与合同规定的品种不符或品种不纯导致大麦质量下降，则不但使我国在对外贸易中蒙受直接经济损失，也使我国啤酒工业遭受间接经济损失。所以，准确鉴别大麦品种是进口啤酒大麦品质检验中非常重要的工作，属于法定检验项目；然而，对于进口啤酒大麦品种的鉴定工作在质检系统内开展非常少。因此，开展进口啤酒大麦品种鉴定工作对于避免贸易经济损失、保证啤酒大麦质量及提高啤酒酿造业的生产效益等方面具有重要意义。
啤酒大麦的品种鉴定方法主要包括根据大麦形态特征进行鉴定的感官检验法和醇溶蛋白电泳法，但是由于感官检验法主观误差大，醇溶蛋白电泳法染色效果差、条带图像不容易判别等问题，这些方法不能满足实际的工作需要。DNA分子标记技术为大麦品种及纯度鉴定工作提供更大的研究手段和空间。Bunce(徐阿炳，朱睦元，袁妙葆等.RFLP技术及其在大麦研究中的应用[J].大麦科学，1991.2:5-12 4)等(1986)利用RFLP技术与SDS-PAGE对6种大麦品种鉴定进行比较分析；吴亚君(吴亚君，王斌，韩建勋等.采用RAPD-毛细管芯片电泳法鉴定啤酒大麦品系[J].食品与发酵工业，2012,38(2)：174-180.)等采用RAPD-毛细管芯片电泳法对19个啤酒大麦品系进行鉴定；初雷(初雷.酿酒大麦种质资源AFLP分子指纹图谱构建.[D]大连工业大学，硕士论文，2011.)利用AFLP技术对27种国内外酿造大麦品种进行鉴定研究；SSR标记技术的原理是根据SSR两侧的序列相对保守的特性，设计特异引物进行PCR扩增，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。SSR标记对DNA需求量少，多态性高，结果稳定可靠等优点，在大麦品种及纯度鉴定等方面的研究已有相关报道。RUSSELJR(RUSSELJR，FULLERJD，MACAULAYM.Direct comparisons of level of genetic variationamong barley accessions detected by RFLPs，AFLPs，SSRs，and RAPD[G].Symposiam：VInternational Oat conference and VII International Barley Genetics，1996.)等仅用11个SSR标记就区分了包括相同系谱来源在内的24个大麦基因型，并利用4对SSR标记区分这24种大麦品种。杨振华(杨振华.啤酒大麦SSR分子标记PCR反应体系的建立与优化[J].黑龙江农业科学.2015(5)：26-28.)利用正交设计，摸索适用于啤酒大麦遗传分析的SSR-PCR最佳反应体系。
SSR技术多数基于聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，通过比较目的条带的位置进行样品品种的判断，但该法不能准确读出片段大小，只能粗略估计。且该法操作繁琐，在样品数量和SSR位点较多时检测工作费时费力。毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、样品少、应用范围广等优点。发明专利申请CN 201510467448.9提供了一种“SSR引物组及利用该引物组构建麦芽指纹图谱的方法”，该申请是基于TP-M13-SSR标记与毛细管电泳技术相结合，方法具体包括：提取麦芽基因组DNA，利用4对核心SSR引物，对麦芽DNA进行多重PCR扩增，利用毛细管荧光电泳检测PCR产物，对SSR标记数据进行分析，构建21种麦芽标准SSR指纹图谱，并能够有效的鉴定出麦芽品种。但该发明专利需要用到荧光引物，增加了成本；另外，其研究是针对麦芽，而大麦颗粒比麦芽含的蛋白、多糖、多酚等物质相对丰富，DNA的提取也相对复杂；目前大麦DNA的提取多数采用大麦发芽后的叶片来进行，但针对进口啤酒大麦的品种鉴定工作，该DNA提取法无法满足快速通关的要求。目前，在国内还未见基于毛细管电泳技术和SSR分子标记对进口啤酒大麦品种进行高通量鉴定的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中存在的上述问题，提供大麦SSR引物组及利用该引物组、将毛细管电泳技术与SSR-PCR技术结合的构建啤酒大麦品种指纹图谱的方法，以及鉴定进口啤酒大麦品种的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了大麦SSR引物组，其包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
本发明大麦SSR引物组可用于构建啤酒大麦品种指纹图谱。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：
S1、从啤酒大麦种子中提取DNA；
S2、将大麦SSR引物组和S1提取得到的DNA分别进行SSR-PCR扩增反应，再将扩增得到的PCR产物进行毛细管凝胶电泳检测；
S3、将所述毛细管凝胶电泳检测结果转化成啤酒大麦品种指纹图谱；
所述大麦SSR引物组，包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
优选地，选取5个主要贸易国的21种进口啤酒大麦种子提取DNA：阿根廷2中(Scarlett、Bambina)、丹麦1种(Quench)、法国6种(Irina、Sebastian、Esterel、Cervoise、Prestige、Etincel)、加拿大2种(Metcalfe、Copeland)、澳大利亚10种(Hindmarsh、Baudin、Scope、Buloke、Traveler、Bass、Westminster、La Trobe Trial、Vlamingh、Gairdner)。
优选地，S2中，所述SSR-PCR扩增反应采用20μl反应体系，包括16μl mix、2μl引物、2μl DNA模板和6μl超纯水；所述引物是将所述大麦SSR引物组中的一组按照1:9的体积比加入超纯水稀释并正反混合得到；
所述SSR-PCR扩增反应的程序为：4℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存；9对大麦SSR引物的退火温度分别为：HVHVA1 52℃、HVM70 54℃、HVMLOH1A46℃、GBM1008 50℃、HVPLASC1B 47℃、HVM65 47℃、HVCMA50℃、HVM6 45℃、HVM63 53℃、WMS6 50℃。
本发明还提供了一种啤酒大麦品种指纹图谱，其是通过上述啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法构建得到。
本发明啤酒大麦品种指纹图谱可用于鉴定啤酒大麦品种。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种啤酒大麦品种的鉴定方法，其是通过啤酒大麦品种指纹图谱完成，包括如下步骤：
S101、从待鉴定啤酒大麦种子中提取DNA；
S102、将大麦SSR引物组和S101提取得到的DNA分别进行SSR-PCR扩增反应，再将扩增得到的PCR产物进行毛细管凝胶电泳检测；
S103、将所述毛细管凝胶电泳检测结果与所述啤酒大麦品种指纹图谱比对，即可得到待鉴定啤酒大麦种子的品种；
所述大麦SSR引物组，包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
其中，9对大麦SSR引物中的任意一对均可鉴定Scarlett、Bambina或Quench；同一个国家的品种可以利用不同引物进行组合实现有效鉴别，如：9对大麦SSR引物中的HVCMA+HVCMA+HVM6组合、HVCMA+HVCMA+HVM65组合、HVCMA+HVCMA+GBM1008组合、HVCMA+HVCMA+HVMLOH1A组合中的任意一个组合可鉴定Irina、Sebastian、Esterel、Cervoise、Prestige或Etincel；9对大麦SSR引物中的HVHVA1+HVM70+HVMLOH1A组合可鉴定Metcalfe、Copeland、Hindmarsh、Baudin、Scope、Buloke、Traveler、Bass、Westminster、La Trobe Trial、Vlamingh或Gairdner。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明利用毛细管电泳技术，实现了SSR分子标记与高效、自动化毛细管电泳技术的有益结合，检测结果由分析软件自动保存，检测速度快，分离效率高，灵敏度较高，精确度达到1bp之内，有利于大批量样品的检测分析，为SSR分子标记技术在啤酒大麦品种鉴定中的推广和应用打下了坚实的基础。
(2)本发明可实现对啤酒大麦麦粒进行DNA提取，不同于目前研究多数采取大麦叶片进行DNA提取方法，本发明提供的大麦颗粒DNA提取方法，无需等麦芽萌发，缩短了实验时间，满足口岸快速通关需要。
(3)本发明啤酒大麦品种的鉴定方法成本低，试剂耗材市场成熟，不计人工与仪器损耗，一个样品的检测成本低于10元。
(4)本发明啤酒大麦品种的鉴定方法的实施例中，大麦SSR引物组对21种进口啤酒大麦品种所得到的特异性位点中，在同一位点上，有的品种有条带，有的则没有，根据位点间不同品种的特异性差别，可将这21种进口啤酒大麦全部分开，且具有重复性好、多态性较高的优点。
附图说明
图1为引物HVHVA1对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图2为引物HVM70对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图3为引物HVMLOH1A对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图4为引物GBM1008对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图5为引物HVPLASC1B对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图6为引物HVM65对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图7为引物HVCMA对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图8为引物HVCMA对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图9为引物WMS6对啤酒大麦SSR-PCR产物毛细管凝胶电泳结果。
图1～9中，01为阿根廷Scarlett，02为阿根廷Bambina，03为丹麦Quench，04为法国Irina，05为法国Sebastian，06为法国Esterel，07为法国Cervoise，08为法国Prestige，09为法国Etincel，10为加拿大Metcalfe，11为加拿大Copeland，12为澳大利亚Hindmarsh，13为澳大利亚Baudin，14为澳大利亚Scope，15为澳大利亚Buloke，16为澳大利亚Traveler，17为澳大利亚Bass，18为澳大利亚Westminster，19为澳大利亚La Trobe Trial，20为澳大利亚Vlamingh，21为澳大利亚Gairdner。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
如无特别说明，以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例
1、啤酒大麦品种的选择
啤酒大麦种子样品来源于5个主要贸易国21种品种：阿根廷2种(Scarlett、Bambina)、丹麦1种(Quench)、法国6种(Irina、Sebastian、Esterel、Cervoise、Prestige、Etincel)、加拿大2种(Metcalfe、Copeland)、澳大利亚10种(Hindmarsh、Baudin、Scope、Buloke、Traveler、Bass、Westminster、La Trobe Trial、Vlamingh、Gairdner)。
2、生化试剂
植物基因组DNA提取试剂盒(广州双螺旋基因技术有限公司)；PCR扩增用的Mix(由Es Taq DNA Polymerase、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，并加入蓝色染料)购自北京擎科新业生物技术有限公司；10对SSR引物购自加拿大生工公司上海分公司；DNF-900双链DNA试剂盒(Advanced Analogic Technologies Inc.)。
3、SSR引物序列
根据已报道的遗传图谱信息以及相关报道，筛选出均匀分布于大麦6条染色体的9对大麦SSR引物，具体见表1。
表1大麦SSR引物组序列
引物名称 染色体 5’—3’ 3’—5’ 重复基序
HVHVA1 1H SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 (ACC)5
HVCMA 1H SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 (AT)9
HVM70 3H SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 (CA)8
HVMLOH1A 4H SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 (GA)6
WMS6 4H SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 (GA)40
GBM1008 6H SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 (AAC)10
HVM65 6H SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 (GA)10
HVPLASC1B 7H SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 (TCTAC)4
HVM6 7H SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 (GA)9
4、仪器设备
离心机(Centrifuge 5418)，核酸定量仪，电泳仪(BG-Power-300)，Eppendorf梯度PCR仪，毛细管电泳仪(Advanced Analytical)。
5、啤酒大麦种子颗粒的DNA提取方法
1)将备选样品用液氮研磨成粉末，备用；
2)、取0.02g粉末至1.5ml离心管中，加入400μl Buffer ALT(2-Me)和5μl RNaseSolution，涡旋使样品充分分散。65℃金属浴10min，期间涡旋混匀一次；
3)、加入140μl Buffer PS至样品中，涡旋20s混匀，冰上放置10min，10000rpm离心5min；
4)、小心转移300μl上清液至新的离心管中，加入450μl Buffer PBD至样品中，涡旋20s；
5)、把DNA结合柱装在2ml收集管，转移混合液体至结合柱中，10000rpm离心60s；
6)、倒弃滤液，并把结合柱装回收集管，加入600μl Buffer GW2至结合柱中，10000rpm离心60s；
7)、倒弃滤液，把结合柱装回收集管，10000rpm离心2min，去除残留的乙醇；
8)、将结合柱转移至新的1.5ml离心管中，加入35μl预加热到65℃的Buffer AE至结合柱膜中央，室温静止2min，10000rpm离心2min。
9)、丢弃DNA结合柱，收集提取液，并进行核酸含量检测，并将DNA保存在-20℃，备用。
6、SSR-PCR反应体系及扩增程序
PCR反应采用20μl体系，包括16μlmix，2μl引物(按1：9比例加入超纯水稀释并正反混合)，2μlDNA模板，6μl超纯水。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各引物退火温度不同：HVHVA1退火52℃，HVM70退火54℃，HVMLOH1A退火46℃，GBM1008退火50℃，HVPLASC1B退火47℃，HVM65退火47℃，HVCMA退火50℃，HVM6退火45℃，HVM63退火53℃，WMS6退火50℃)，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
7、PCR产物毛细管电泳检测分析
使用DNF-900双链DNA试剂盒，具体步骤如下：
1)将5X 930双链DNA Inter Buffer用超纯水稀释至1X 930DNA Inter Buffer，加入1ml深孔96孔板中，每孔加入1ml，放置在毛细管电泳仪B层，可重复使用；
2)将一块干净的1ml深孔96孔板放置在毛细管电泳仪W层；
3)将35-500bp Marker加入1ml 96孔无裙边PCR板中，每孔30μl，并覆盖20μl矿物油；放置在毛细管M层，可重复使用；
4)准备一块干净的1ml 96孔无裙边PCR板，点样孔加入22μl 1X TE dilutionbuffer，和2μl待测DNA样品，最后两孔加入24μl DNA Ladder，其余孔加入24μl 1X TEdilution buffer，离心混匀，放置在毛细管1层中；
5)将40ml Separation Gal加入250ml圆锥形瓶中，并加入2μl IntercalatingDye染色，混匀，并插入Gal液体管；
6)将5X Capillary Conditioning Solution用超纯水稀释成1X CapillaryConditioning Solution，加入250ml圆锥形瓶中，并插入Conditioning液体管；
7)打开Fragment Analyzer仪器控制软件，添加Full Condition、DNF-900ReagentKit Method 35-500bp程序并运行。
8、数据处理方法
利用PROSize 2.0软件对SSR标记的毛细管电泳结果进行分析，统计同一对SSR引物扩增条带在各个样品中的有无和片段大小差异。
9、9对引物构建21种进口啤酒大麦的SSR标准指纹图谱
根据不同SSR引物对21种进口啤酒大麦品种的PCR扩增图谱(图1-9)可知，9对SSR引物应用于啤酒大麦均有效，扩增出的DNA片段大小在110-200bp之间，共计21个特异性条带位点；根据不同位点，不同大麦品种特异性条带的有或无，转化成为易于识别的计算机系统语言(1代表有，0代表无)，形成直观、便于分析鉴定的SSR指纹图谱，具体详见表2。
表2 9种SSR引物对进口21种啤酒大麦品种鉴定的指纹图谱
根据表2可以得知，每种啤酒大麦都具有自己区别于其它品种的特异性条带，如：阿根廷两个品种差异明显，Scarlett在位点115bp、133bp、163bp、174bp、125bp、105bp、148bp、160bp、170bp、186bp、200bp、163bp处具有特异性条带，而在118bp、130bp、131bp、110bp、125bp、138bp、177bp处没有条带显示；Bambina在位点161bp、148bp、160bp、186bp处具有特异性条带，而其他位点无条带显示；由此可见，阿根廷Scarlett和Bambina两个品种在利用SSR技术进行种间区别时，9种引物均有效。通过指纹图谱分析，阿根廷Scarlett大麦品种可以找到相对供试的21种进口大麦而言的的特异性SSR引物共有2个：HVHVA1、HVCMA，这2个引物对该品种产生的条带位点均与其他品种不同；HVMLOH1A和GBM1008均可以有效的鉴别加拿大Metcalfe和Copeland；其他品种，尤其同一个国家的品种均可以利用不同引物的组合，进行品种间定性区分，如：HVCMA+HVCMA+HVM6；HVCMA+HVCMA+HVM65；HVCMA+HVCMA+GBM1008；HVCMA+HVCMA+HVMLOH1A共计4种组合可以有效的区分法国的6个品种；HVHVA1+HVM70+HVMLOH1A的组合可以有效区分出澳大利亚的10个品种。
总的来说，根据9种EST-SSR引物对21种进口啤酒大麦品种所得到的特异性位点中，在同一位点上，有的品种有条带，有的则没有，根据位点间不同品种的特异性差别，可以将这21种进口啤酒大麦全部分开，并且重复性好，多态性较高。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 中华人民共和国南沙出入境检验检疫局
<120> 大麦SSR引物组及利用该引物组构建啤酒大麦品种指纹图谱的方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> HVHVA1 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 1
catgggaggg gacaacac 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> HVHVA1 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaccaaaca cgactaaagg a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> HVCMA 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaaagcaaa tgttgagcaa cg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> HVCMA 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctcggttt ggacatataa ag 22
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> HVM70 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgccgatga ccttctc 17
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> HVM70 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 6
acccacgacc tatggcac 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> HVMLOH1A 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 7
cctcccctct gatatgataa 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> HVMLOH1A 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 8
gtacagacgg tttaattgtc c 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> WMS6 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 9
agccttatca tgaccctacc tt 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> WMS6 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtatcacct cctagctaaa ctag 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> GBM1008 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatcataac agcaatggac a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> GBM1008 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 12
tctcggtttg tgacgctatg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> HVM65 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 13
tggtaacttg tcccccaaag 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> HVM65 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 14
agacatccaa aaaatgaacc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> HVPLASC1B 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 15
gtgcatgcat catattgatt a 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> HVPLASC1B 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 16
acgtacgtac ttatcacgaa ga 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> HVM6 5’—3’(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcatccgta tgtatgagta a 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> HVM6 3’—5’(Artificial Sequence)
<400> 18
catgaatgaa tgattggttt tg 22

Claims (9)

1.大麦SSR引物组，其特征在于，包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
2.权利要求1所述大麦SSR引物组在构建啤酒大麦品种指纹图谱中的应用。
3.一种啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从啤酒大麦种子中提取DNA；
S2、将大麦SSR引物组和S1提取得到的DNA分别进行SSR-PCR扩增反应，再将扩增得到的PCR产物进行毛细管凝胶电泳检测；
S3、将所述毛细管凝胶电泳检测结果转化成啤酒大麦品种指纹图谱；
所述大麦SSR引物组，包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
4.根据权利要求3所述的啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，S1中，所述啤酒大麦种子分别为：Scarlett、Bambina、Quench、Irina、Sebastian、Esterel、Cervoise、Prestige、Etincel、Metcalfe、Copeland、Hindmarsh、Baudin、Scope、Buloke、Traveler、Bass、Westminster、La Trobe Trial、Vlamingh、Gairdner。
5.根据权利要求3所述的啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，S2中，所述SSR-PCR扩增反应采用20μl反应体系，包括16μl mix、2μl引物、2μl DNA模板和6μl超纯水；所述引物是将所述大麦SSR引物组中的一组按照1:9的体积比加入超纯水稀释并正反混合得到；
所述SSR-PCR扩增反应的程序为：4℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存；9对大麦SSR引物的退火温度分别为：HVHVA1 52℃、HVM70 54℃、HVMLOH1A 46℃、GBM1008 50℃、HVPLASC1B 47℃、HVM65 47℃、HVCMA 50℃、HVM6 45℃、HVM63 53℃、WMS6 50℃。
6.一种啤酒大麦品种指纹图谱，其特征在于，由权利要求3或4或5中任意一条权利要求所述啤酒大麦品种指纹图谱的构建方法构建得到。
7.权利要求6所述啤酒大麦品种指纹图谱在鉴定啤酒大麦品种中的应用。
8.一种啤酒大麦品种的鉴定方法，其特征在于，其是通过权利要求6所述啤酒大麦品种指纹图谱完成，包括如下步骤：
S101、从待鉴定啤酒大麦种子中提取DNA；
S102、将大麦SSR引物组和S101提取得到的DNA分别进行SSR-PCR扩增反应，再将扩增得到的PCR产物进行毛细管凝胶电泳检测；
S103、将所述毛细管凝胶电泳检测结果与所述啤酒大麦品种指纹图谱比对，即可得到待鉴定啤酒大麦种子的品种；
所述大麦SSR引物组，包括9对大麦SSR引物HVHVA1、HVM70、HVMLOH1A、GBM1008、HVCMA、WMS6、HVPLASC1B、HVM65和HVM6，各引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～18所示。
9.根据权利要求8所述啤酒大麦品种的鉴定方法，其特征在于，所述9对大麦SSR引物中的任意一对均可鉴定Scarlett、Bambina或Quench；所述9对大麦SSR引物中的
HVCMA+HVCMA+HVM6组合、HVCMA+HVCMA+HVM65组合、HVCMA+HVCMA+GBM1008组合、HVCMA+HVCMA+HVMLOH1A组合中的任意一个组合可鉴定Irina、Sebastian、Esterel、Cervoise、Prestige或Etincel；所述9对大麦SSR引物中的HVHVA1+HVM70+HVMLOH1A组合可鉴定Metcalfe、Copeland、Hindmarsh、Baudin、Scope、Buloke、Traveler、Bass、Westminster、LaTrobe Trial、Vlamingh或Gairdner。
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