CN111593133B

CN111593133B - 多重荧光pcr鉴别四种花粉的方法、组合物和试剂盒

Info

Publication number: CN111593133B
Application number: CN201910126399.0A
Authority: CN
Inventors: 吴亚君; 杨艳歌; 刘鸣畅; 王洪越; 黄文胜; 王迎春
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-02-20
Filing date: 2019-02-20
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-02-20
Also published as: CN111593133A

Abstract

本发明涉及花粉中油菜花粉、茶花花粉、荷花花粉和松花粉的单重和多重实时荧光PCR物种鉴别方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测花粉中上述植物成分的方法。使用本发明的组合物进行单重和多重实时荧光PCR检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测花粉、花粉豆、花粉片等花粉制品中油菜、茶、荷和松成分。

Description

多重荧光PCR鉴别四种花粉的方法、组合物和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测花粉中油菜、茶、荷和松成分的单重和多重Taqman实时荧光PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒，以及使用所述引物和探针或试剂盒检测花粉中油菜、茶、荷、松成分的方法。本发明还涉及所述引物和探针在检测花粉中上述植物成分的应用。

背景技术

花粉是有花植物雄蕊中雄性生殖细胞,它包含着孕育植物新生命所需的全部营养成分和精华。蜂花粉是蜜蜂采集被子植物雄蕊或裸子植物小孢子囊内的花粉细胞形成的团粒状物，不仅包含了花粉还被加入了蜜蜂腺上分泌物和唾液。蜂花粉营养丰富，被人们誉为“浓缩的营养库”、“浓缩的微型天然药剂”、“完全营养食品”等。作为一种新型的天然健康食品，蜂花粉产品主要为以天然花粉颗粒、破壁花粉开发成的冲剂、片剂和胶囊产品，同时也正在向提取物高附加值产品方向发展，甚至包括药物。蜂花粉产品越来越受到国内外消费者关注，不仅国内消费量逐年上升，而且在出口方面具备韩国、日本、美国、墨西哥等广大的国际市场，其产业开发价值和市场潜力巨大。

花粉种类繁多，不同植物源、地源的花粉，其营养成分及功效差异较大，但在形态和色泽上相对接近，容易被不法商家利用，对昂贵的花粉采用“以次充好”、“以廉代贵”的手段谋取暴利。如油菜花粉、茶花粉、荷花粉、松花粉均呈黄色，但油菜花粉主要功效是具有益肾、固本、强腰、对前列腺炎和前列腺增生有显著疗效，而且含黄酮醇较高，具有抗动脉粥样硬化、治疗静脉曲张性溃疡、降低胆固醇和抗辐射的作用。茶花粉颜色有清头目、除烦渴、化痰、消食、利尿、解毒、美容之功效。松花粉有祛风益气，收湿，止血的功能等。

目前，国内外对花粉的种属鉴定一般采用扫描电子显微镜进行形态学鉴定，对测定者和仪器的要求都很高，检测成本昂贵，不易推广和标准化。多重实时荧光PCR技术是一种高通量、高灵敏度、高特异性、快速精准的分子生物学检测方法和手段。建立花粉及产品中主成分和掺杂成分的多重实时荧光PCR检测，可以实现在同一个反应体系里面对多个花粉靶基因的检测，检测效率更高，特异性和灵敏度，也达到扩增反应的要求。

发明内容

本发明的目的在于高通量、简单、快速、特异且灵敏地检测花粉及产品中的油菜、茶、荷和松成分，能对花粉及产品中的物种成分进行真伪鉴别，能有效防止花粉中掺杂非标识或廉价花粉。

本发明的发明人根据茶和松的叶绿体maturase K基因，设计了能特异性检测茶和松成分的引物和探针，其中茶靶序列为152bp，松靶序列为271bp。并根据荷花ITS基因，设计了能特异性检测荷成分的引物和探针，靶序列为72bp。特异性检测油菜的引物探针序列引用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1197-2016《油菜中转基因成分检测普通PCR和实时荧光PCR方法》，靶基因为PEP基因，扩增靶序列为110bp。上述4对引物探针保证能从不同加工程度的花粉产品中检测目标油菜、茶、荷、松植物源性成分。

所述特异性检测茶成分的寡核苷酸引物上游Camellia-F:5’-TATCCAAATACCAAATTCGCCTTC-3’(SEQ ID No.1)，和下游Camellia-R:5’-TAAACACAAAAGTACGGTACGTGCT-3’(SEQ ID No.2)。探针为Camellia-P:5’-TCTTTGACCTTCCCTTCTTCTACTTCGCA-3’(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团VIC。检测松成分的寡核苷酸引物上游Pine-F:5’-GTTCGGACCAAAGATGGAAATAA-3’(SEQ ID No.4)，和下游Pine-R:5’-TCCCGTCTTAAACGATCCTCTC-3’(SEQ ID No.5)。探针为Pine-P:5’-TCGTTGTCTCATGGATCTTTCCCTCAGC-3’(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团JUN。检测荷成分的寡核苷酸引物上游Lotus-F:5’-TGGACGTTGTGTACGTTGTGTTG-3’(SEQ ID No.7)，和下游Lotus-R:5’-CTCCGTCAACAACGGATCCCTAA-3’(SEQ ID No.8)。探针为Lotus-P:5’-CATTGGGGTGTCGAGTGTGTGACCCG-3’(SEQ ID No.9)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团ABY。特异性检测油菜的引物探针序列引用中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1197-2016《油菜中转基因成分检测普通PCR和实时荧光PCR方法》，寡核苷酸引物上游:F:5'-CCCTTGTGAAGCTCGACATC-3'，下游引物R:5'-CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT-3'，探针序列为P:CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团QSY，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物，所述组合物包含选自以下(1)至(3)中的任意一组或多组引物和探针序列：

(1)茶特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1～SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3序列；

(2)松特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及探针SEQ ID No.6序列；

(3)荷特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7和SEQ ID No.8以及探针SEQ ID No.9序列；

在一个实施方案中，本发明提供了通过单重和多重实时荧光PCR方法快速检测花粉中油菜、茶、荷、松植物源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明的用于多重和单重实时荧光PCR方法检测油菜、茶、荷、松成分的特异性寡核苷酸引物特异性引物对、探针、荧光PCR反应所需试剂和使用说明书。

优选的，所述单一实时荧光PCR反应体系为25μL，包含12.5μL Taqman GeneExpression Master Mix，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10μmol/L探针0.5μL，模板DNA 5μL(5ng/μL)，无菌ddH2O 6μL。

多重实时荧光PCR反应，4种不同荧光的浓度为20μmol/L的上游、下游引物和探针分别按照1:1:1:1混合配置成Primer Mix和Probe Mix，对应的4种5ng/μL花粉基因组DNA等体积混合配置成DNA mix。总体积25μL包含12.5μL TaqMan Multiplex Master Mix，上下游混合引物各1μL，Probe Mix 1μL，DNA mix 5μL，无菌ddH2O 5μL。

在一个实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测花粉中油菜、茶、荷、松的单重和多重实时荧光PCR扩增的条件的描述。所述试剂盒的说明书中给出的油菜、茶、松、荷单重和多重实时荧光PCR扩增条件均为是50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。优选地，本发明所使用单重和多重实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。

在一个实施方案中，本发明的茶特异性引物根据茶序列设计。所述试剂盒中包含茶matK基因特异性扩增靶序列为:TATCCAAATACCAAATTCGCCTTCTATATAACCCCTGCGAAGTAGAAGAAGGGAAGGTCAAAGAAAAAACTTGTTCTTCCCCCATAAAGAATTCTTCCAATAATTCCGAGCCTAATCTTTTCAAAAAAGCACGTACCGTACTTTTGTGTTTA(SEQ No.10)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测茶特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测茶成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

在另一个实施方案中，本发明的松特异性引物根据松matK基因序列设计。所述试剂盒中包含松特异性扩增靶序列为:GTTCGGACCAAAGATGGAAATAAAATTGCCGAAAAATTAGAAGATAATATCTACATTTTTTAACTAGGAGATCAGCACCCTTTATAGCTATAATAGGTCTTTCGCCATATCTAACATAGTGAATTTTAGGATCCTTCAACGACCAGATACTTTTCAGTGAATTTCGACGAGAAAAAATGATAATATGTTTTATCTTTCGATGAAAATGAGTTCGCTGAGGGAAAGATCCATGAGACAACGATCGTGAATGAGAGGATCGTTTAAGACGGGA(SEQ No.11)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测松特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测松成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

在另一个实施方案中，本发明的荷特异性引物分别根据荷ITS序列设计。所述试剂盒中包含荷特异性扩增靶序列为:TGGACGTTGTGCACGTTGTGTTGTCATTGGGGTGTCGAGTGTGTGACCCGATTAGGGATCCGTTGTTGACGG(SEQ No.12)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于单重和多重实时荧光PCR检测荷特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测荷成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法中茶和油菜成分的绝对灵敏度最低均为10pg/μL，松和荷花成分的绝对灵敏度最低均为1pg/μL。

在一个实施方案中，多重实时荧光PCR检测油菜的绝对灵敏度最低为10pg/μL，茶的绝对灵敏度最低为100pg/μL，松和荷成分的绝对灵敏度最低为1pg/μL。

在一个实施方案中，所述单重实时荧光PCR检测方法的最低检出限为油菜1％，松、荷和茶的最低检出限为0.1％。多重实时荧光PCR检测方法油菜的最低检出限为0.5％，松、荷和茶的最低检出限为0.1％。

再在一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在鉴别花粉及其制品中油菜、茶、荷、松成分的应用。

实时荧光PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。而TaqMan探针法的原理是当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。多重实时荧光PCR是在一个PCR扩增体系中，含有数对探针引物，同时扩增数个靶核酸，提高了反应的通量。

本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR检测方法特异性高，假阳性低；多重实时荧光PCR提高了反应通量，缩短了反应时间。具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的单重和多重实时荧光PCR检测方法，可用于国内外市场上花粉及产品中油菜、茶、荷、松成分的定性检测。

附图说明

图1是利用单重实时荧光PCR检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉引物探针特异性时出现的典型的扩增曲线，检测样品分别为：油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉、猕猴桃花粉、柳树花粉、荞麦花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆条、月季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹果、梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆、无菌水，每个样品2个平行。

图2A是利用单重实时荧光PCR检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉引物探针绝对灵敏度时的扩增曲线，图2B是利用单重实时荧光PCR检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉引物探针绝对灵敏度时仪器自动生成的标准曲线，每个曲线下方的R2值、扩增效率、斜率默认仪器自动生成。检测的DNA浓度梯度从100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL到0.0001ng/μL，每个稀释度3个平行。

表1是使用单重实时荧光PCR方法检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉相对灵敏度检测结果分析，混合样品比例分别为0.1％，1％，10％，50％，90％，100％每个稀释度3个平行，方差用SD值表示。

图3是使用多重实时荧光PCR方法检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉特异性时出现的典型的扩增曲线。检测样品分别为：油菜花粉、茶花花粉、荷花花粉、松花粉、猕猴桃花粉、柳树花粉、荞麦花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉、玉米、五味子、洋槐、党参、荆条、月季、巨桉、椴树、紫云英、枣、西瓜、白芝麻、黑莓、板栗、杏仁、菊花、葵花、银杏、黄瓜、苹果、梨、桃、橙、山楂、薰衣草、蚕豆，空白对照为无菌水，每个样品2个平行。

图4是利用多重实时荧光PCR检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉引物探针绝对灵敏度结果的标准曲线分析。DNA浓度梯度为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，0.0001ng/μL，每个稀释度2个平行。

表2是使用多重实时荧光PCR方法检测油菜花粉、荷花粉、茶花粉、松花粉最低检出限检测结果分析，混合样品比例分别为1％，0.5％，0.1％，每个稀释度3个平行，方差用SD值表示。

具体实施方式

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.一种用于多重实时荧光定量PCR检测茶花粉和松花粉的组合物，所述组合物由用于检测茶花粉的上游引物5’-TATCCAAATACCAAATTCGCCTTC-3’、下游引物5’-TAAACACAAAAGTACGGTACGTGCT-3’、探针5’-TCTTTGACCTTCCCTTCTTCTACTTCGCA-3’和用于检测松花粉的上游引物5’-GTTCGGACCAAAGATGGAAATAA-3’、下游引物5’-TCCCGTCTTAAACGATCCTCTC-3’、探针5’-TCGTTGTCTCATGGATCTTTCCCTCAGC-3’组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，用于检测茶花粉的探针和用于检测松花粉的探针的3’端连接荧光淬灭基团QSY，用于检测茶花粉的探针和用于检测松花粉的探针的5’端分别连接荧光报告基团VIC和JUN。

3.一种用于多重实时荧光定量PCR检测茶花粉和松花粉的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的组合物。

4.一种检测茶花粉和松花粉的多重实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1-2任一项所述的组合物或权利要求3所述的试剂盒进行检测。

5.权利要求1-2中任一项所述的组合物在花粉产品中茶和/或松成分鉴别中的应用。