CN103215373B

CN103215373B - 用于检测蜂蜜的组合物、试剂盒、检测方法及应用

Info

Publication number: CN103215373B
Application number: CN201310170812.6A
Authority: CN
Inventors: 吴亚君; 陈颖; 王斌; 刘鸣畅; 韩建勋
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: CN103215373A

Abstract

本发明涉及用于蜂蜜中龙眼、荔枝、洋槐、油菜蜜源植物成分检测的寡核苷酸引物及探针，包含所述引物及探针的试剂盒，以及利用其检测蜂蜜中上述蜜源植物成分的方法。通过本发明，能够简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的上述蜜源植物成分。

Description

用于检测蜂蜜的组合物、试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于检测蜂蜜中蜜源植物成分的寡核苷酸引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及使用所述引物和探针或试剂盒检测蜂蜜中蜜源植物成分的方法。本发明还涉及所述引物和探针在检测蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。

背景技术

蜂蜜，是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质。蜜源植物种类繁多，如油菜蜜、槐花蜜、荆条蜜、枣花蜜、龙眼蜜、荔枝蜜等等。不同蜜源蜂蜜价格相差较大，高端价位如龙眼蜜和荔枝蜜，低端价位如油菜蜜等。蜂蜜掺假中一种较为普遍的做法是将低价蜜源蜂蜜掺入高价蜜源蜂蜜。针对这类掺假，传统的检测方法，如感官法、物理性状、化学成分分析等，由于受到生产、加工、贮藏条件影响存在很多不确定性。分子生物学技术通过检测植物物种特异性基因片段来判断蜜源，具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点。

发明内容

本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测蜂蜜中的荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分。通过本发明，不仅能检测蜂蜜中花粉沉淀中提取的DNA，而且能检测蜂蜜上清中提取的DNA，能有效防止蜂蜜中添加花粉或过滤花粉的造假方式。

本发明的发明人根据油菜的隐花色素2b基因，设计了能够特异性检测油菜成分的引物和探针；根据洋槐叶绿体pseudoacacia maturase K基因，设计了特异性检测洋槐成分的引物和探针；根据荔枝成熟酶K基因，设计了能同时特异性检测荔枝和龙眼成分的引物和探针。根据龙眼叶绿体铁超氧化物歧化酶(FSD1b)基因，设计了特异性检测龙眼成分的引物和探针。这些基因靶序列小于100bp，保证能从蜂蜜沉淀及上清中检测目标植物成分。

所述油菜特异性上游引物为Bras-cry-F:GAGGATAACCCCGCACTAGC(SEQ ID No.1)，下游引物为Bras-cry-R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC(SEQ ID No.2)；探针为Bras-cry-P:TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。洋槐特异性上游引物为Rob-matK-F:GCTCAACCAGGAACGATC(SEQ ID No.4),下游引物为Rob-matK-R:GCAGCATTTGACTACGTACCA(SEQ ID No.5)；探针为Rob-matK-P:CATAAACCTATTATCCGAACATTCATTTCA(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼和荔枝特异性上游引物为Lit-matK-F:TCATGTGTGGTCTCAACCCG(SEQ ID No.7),下游引物为Lit-matK-R：CGTCGCCGACTGGAAAGATA(SEQ ID No.8)；探针为Lit-matK-P:TTACACAAAGATTCTATCAACTTTCTGGGC(SEQ ID No.9)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。龙眼特异性上游引物为Longan-FSD-F:CCCAAGCTTCCTGATTGGGT(SEQ ID No.10),下游引物为Longan-FSD-R:AGGTGGTGTTTGTCGCTTCT(SEQ ID No.11)；探针为Longan-FSD-P:CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTAG(SEQ ID No.12)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

一方面，本发明提供了用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列：

（1）油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3序列；

（2）洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及探针SEQ ID No.6序列；

（3）荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7和SEQ ID No.8以及探针SEQ ID No.9序列；

（4）龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.10和SEQ ID No.11以及探针SEQ ID No.12序列。

在一个实施方式中，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团。

在一个实施方式中，所述荧光淬灭基团为TARMA，所述荧光报告基团为FAM。

在本发明中，蜜源植物为荔枝、龙眼、洋槐和油菜中的一种或多种。

另一方面，本发明提供了用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的所述组合物。

在一个实施方案，本发明提供了用于快速检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是：95℃，10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龙眼蜜源植物成分的试剂盒还包括标准品和对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

再一方面，本发明提供了蜂蜜中蜜源植物成分鉴别的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的所述组合物或试剂盒。

在一个实施方式中，PCR扩增条件是95℃，10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。优选地，本发明所使用的实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。

在一个实施方案中，本发明的蜂蜜中荔枝、龙眼、洋槐、油菜蜜源植物成分实时荧光PCR检测方法还进一步包括提取样品总DNA和确定特异性寡核苷酸引物和探针组合的相对检测限的步骤。

在本发明中，所述实时荧光PCR检测方法检测出荔枝或龙眼成分的检测限为0.0005ng/μL，洋槐成分的检测限为0.0005ng/μL，油菜成分的检测限为0.005ng/μL，龙眼成分的检测限为0.005ng/μL。

在本发明中，所述实施荧光PCR检测方法检测荔枝蜜与油菜蜜混样沉淀DNA，其中荔枝成分检测限为0.1%，油菜成分的检测限为0.1%；上清DNA中荔枝成分检测限为0.1%，油菜成分检测限为5%。

在本发明中，所述实施荧光PCR检测方法检测龙眼蜜与洋槐蜜混样沉淀DNA，其中龙眼成分检测限为1%，洋槐成分的检测限为0.1%；上清DNA中龙眼成分检测限为1%，洋槐成分检测限为0.1%。

再在一方面，本发明提供了本发明的所述组合物或所述试剂盒在鉴别蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。

实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测蜜源植物成分。

本发明的实时荧光PCR检测方法可采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上蜂蜜蜜源植物的检测。

附图说明

图1是利用实时荧光PCR特异性检测油菜DNA(cryptochrome2b)区序列时，油菜样品出现典型的扩增曲线。其中使用油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和探针SEQ ID No.3检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.油菜；2.荔枝；3.洋槐；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.桂圆；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图1中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图2是利用实时荧光PCR特异性检测洋槐DNA(pseudoacacia maturaseK)序列时，洋槐样品出现典型的扩增曲线。其中使用洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针SEQ ID No.6检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.洋槐；2.荔枝；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.桂圆；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图2中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图3是利用实时荧光PCR特异性检测荔枝DNA(成熟酶K)序列时，荔枝和龙眼样品出现典型的扩增曲线。其中使用荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7和SEQ ID No.8和探针SEQ ID No.9检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.荔枝；2.龙眼；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.洋槐；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图3中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图4是利用实时荧光PCR特异性检测龙眼DNA(铁超氧化物歧化酶)序列时，龙眼样品出现典型的扩增曲线。其中使用龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.10和SEQ ID No.11和探针SEQ ID No.12检测，荧光曲线编号与样品对应如下：1.龙眼；2.荔枝；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.苹果；7.桃；8.大豆；9.大麦；10.大米；11.黄瓜；12.胡萝卜；13.洋槐；14.桔子；15.荆条；16.银杏；17.枇杷；18.枣；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.骆驼；25.马；26.牛；27.鸭；28.羊；29.鱼；30.猪；31.空白；图4中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图5-图8分别是检测油菜、洋槐、荔枝和龙眼、龙眼特异性寡核苷酸引物和探针组合的灵敏度的结果，进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度依次为50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl、0.0005ng/μl，其中荧光曲线编号与浓度对应如下：1：50ng/μl；2：5ng/μl；3：0.5ng/μl；4：0.05ng/μl；5：0.005ng/μl；6：0.0005ng/μl；7：空白对照，图中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图9和图10是以油菜蜜和荔枝蜜为例，确定荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物和探针组合的实际检测灵敏度，将油菜蜜和荔枝蜜按比例混合，使荔枝蜜的比例达到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中荧光曲线编号与荔枝蜜比例对应如下：1：阳性对照；2：100%；3：99.9%；4：90%；5：50%；6：10%；7：5%；8：1%；9：0.1%；10：空白对照。图9是蜂蜜沉淀中DNA的检测结果，图10是蜂蜜上清DNA的检测结果。图中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图11和图12是以油菜蜜和荔枝蜜为例，确定油菜特异性寡核苷酸引物和探针组合的实际检测灵敏度，将油菜蜜和荔枝蜜按比例混合，使油菜蜜的比例达到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中荧光曲线编号与油菜蜜比例对应如下：1：100%；2：99.9%；3：90%；4：10%；5：5%；6：1%；7：0.1%；8：空白对照。图11是蜂蜜沉淀中DNA的检测结果，图12是蜂蜜上清DNA的检测结果。图中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图13和图14是以洋槐蜜和龙眼蜜为例，确定龙眼特异性寡核苷酸引物和探针组合的实际检测灵敏度，将洋槐蜜和龙眼蜜按比例混合，使龙眼蜜的比例达到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中荧光曲线编号与龙眼蜜比例对应如下：1：100%；2：99.9%；3：90%；4：10%；5：5%；6：1%；7：0.1%；8：空白对照。图13是蜂蜜沉淀中DNA的检测结果，图14是蜂蜜上清DNA的检测结果。图中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

图15和图16是以洋槐蜜和龙眼蜜为例，确定洋槐特异性寡核苷酸引物和探针组合的实际检测灵敏度，将洋槐蜜和龙眼蜜按比例混合，使洋槐蜜的比例达到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中荧光曲线编号与洋槐蜜比例对应如下：1：100%；2：99.9%；3：90%；4：10%；5：5%；6：1%；7：0.1%；8：空白对照。图15是蜂蜜沉淀中DNA的检测结果，图16是蜂蜜上清DNA的检测结果。图中的横坐标为PCR循环数，纵坐标为PCR相对荧光单位值。

具体实施方式

以下通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过如下试验对荔枝和龙眼、洋槐、油菜、龙眼的引物和探针进行了特异性和灵敏度验证。

检测主要试剂：

氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、0.02mol/L Na₂-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/LCTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl均为本实验自行配制；Fast StartUniversal Probe MasterMix(Rox)购于罗氏公司；引物及探针由上海奥科生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1）DNA提取

检测样本：30份样品，包括洋槐、荔枝、油菜、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桂圆、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪，用于特异性分析。

称取洋槐、荔枝、油菜、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桂圆、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪样品各0.1g至一洁净2.0mL离心管中，加入1.5mLCTAB裂解液，65℃作用2h，间期不断混匀几次；4℃、8000rpm离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，4℃、14500rpm离心10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；4℃14500rpm离心20min，弃上清液，加入350μL1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，4℃、14500rpm离心10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，4℃、14500rpm离心20min，弃上清液，加入500μL70%乙醇，混匀后，4℃、14500rpm离心20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

上述测试样品通过以上所述方法提取DNA。蜂蜜样品使用商业化DNA提取试剂盒（例如Nucleospin，德国Macheney-Nagel公司）提取。

2）实时荧光PCR检测所用引物和探针

所使用的油菜特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.2；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

所使用的洋槐特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.5；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

所使用的荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.7，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.8；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.9，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

所使用的龙眼特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.10，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.11；所使用的探针的碱基序列为SEQ ID No.12，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3）实时荧光PCR反应体系：

TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL

探针(10μM) 2μL

上游引物(10μM) 1μL

下游引物(10μM) 1μL

模板DNA 5μL

加ddH₂O至总体积为25μL

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4）实时荧光PCR反应参数：

95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，利用实时荧光PCR特异性检测油菜DNA(cryptochrome2b)区序列时，油菜样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：荔枝、洋槐、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桂圆、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪、空白均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的油菜特异性寡核苷酸引物和探针对油菜样品表现优异的特异性。

如图2所示，利用实时荧光PCR特异性检测洋槐DNA(pseudoacaciamaturase K)序列时，洋槐样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：荔枝、油菜、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桂圆、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪、空白均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的洋槐特异性寡核苷酸引物和探针对洋槐样品表现优异的特异性。

如图3所示，利用实时荧光PCR特异性检测荔枝DNA(成熟酶K)序列时，荔枝和龙眼样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：油菜、洋槐、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪、空白均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的荔枝特异性寡核苷酸引物和探针对荔枝和龙眼样品表现特异性。

如图4所示，利用实时荧光PCR特异性检测龙眼DNA(铁超氧化物歧化酶)序列时，龙眼样品出现典型的扩增曲线，而其它样品：油菜、洋槐、荔枝、紫云英、梨、苹果、桃、大豆、大麦、大米、黄瓜、胡萝卜、桔子、荆条、银杏、枇杷、枣、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、骆驼、马、牛、鸭、羊、鱼、猪、空白均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的龙眼特异性寡核苷酸引物和探针对龙眼样品表现特异性。

为确定油菜特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的油菜DNA溶液用无菌水分别稀释为50ng/μl、5ng/μl,0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl和0.0005ng/μl的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图5所示，上述油菜DNA浓度50ng/μl-0.005ng/μl，均有特异性扩增曲线出现，重复性良好。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出油菜成分的含量至少为0.005ng/μl。

为确定洋槐特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的洋槐DNA溶液用无菌水分别稀释为50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl和0.0005ng/μl的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图6所示。上述6个洋槐DNA浓度，均有特异性扩增曲线出现，重复性良好。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出洋槐成分的含量至少为0.0005ng/μl。

为确定荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的荔枝DNA溶液用无菌水分别稀释为50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl和0.0005ng/μl的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图7所示。上述6个荔枝DNA浓度，均有特异性扩增曲线出现，重复性良好。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出荔枝成分的含量至少为0.0005ng/μl。

为确定龙眼特异性寡核苷酸引物和探针组合的绝对检测限，将提取的龙眼DNA溶液用无菌水分别稀释为50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、0.05ng/μl、0.005ng/μl和0.0005ng/μl的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图8所示。龙眼DNA浓度50ng/μl-0.005ng/μl，均有特异性扩增曲线出现，重复性良好。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出龙眼成分的含量为0.005ng/μl。

实施例2

本发明的发明人通过如下试验对收集的蜂蜜样品进行了验证。

选取油菜蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、龙眼蜜及其混合物进行实时荧光PCR反应，以确定所建立的实时荧光PCR方法的可行性、特异性、实际灵敏度等。

在本实施例中，使用的特异性探针和进行实时荧光PCR检测的实验操作条件如实施例1中所述。

常规地，扩增待测样品时，重复3次出现1次以上阳性信号即代表检测结果为阳性。

以荔枝蜜和油菜蜜的混合物为例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。如图9所示，荔枝蜜和油菜蜜的比例分别为100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。利用Nucleospin试剂盒从混合物的沉淀物中提取DNA后使用荔枝特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到0.1%的荔枝蜜。如图10所示，利用Nucleospin试剂盒从上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用荔枝特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到0.1%的荔枝蜜。

以荔枝蜜和油菜蜜的混合物为例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。如图11所示，油菜蜜和荔枝蜜的比例分别为100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。利用Nucleospin试剂盒从混合物的沉淀物中提取DNA后使用油菜特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到0.1%的油菜蜜。如图12所示，从上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用油菜特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到5%的油菜蜜。

以龙眼蜜和洋槐蜜的混合物为例，用龙眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。如图13所示，龙眼蜜和洋槐蜜的比例分别为100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%、0.1%。分别从混合物的沉淀物中提取DNA后使用龙眼特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到1%的龙眼蜜。如图14所示，从上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用龙眼特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到1%的龙眼蜜。

以龙眼蜜和洋槐蜜的混合物为例，用龙眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。如图15所示，洋槐蜜和龙眼蜜的比例分别为100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%、0.1%。分别从混合物的沉淀物中提取DNA后使用洋槐特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到0.1%的洋槐蜜。如图16所示，从上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用洋槐特异性引物和探针组合进行实时荧光PCR，结果说明可以检测到0.1%的洋槐蜜。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的组合物，所述组合物包含以下(1)至(4)中的引物和探针序列：

(1)油菜特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3序列；

(2)洋槐特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5以及探针SEQ ID No.6序列；

(3)荔枝和龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7和SEQ ID No.8以及探针SEQ ID No.9序列；

(4)龙眼特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.10和SEQ ID No.11以及探针SEQ ID No.12序列。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述荧光淬灭基团为TAMRA，所述荧光报告基团为FAM。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，蜜源植物为荔枝、龙眼、洋槐和油菜中的一种或多种。

5.用于通过实时荧光PCR方法鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的组合物。

6.鉴别蜂蜜中蜜源植物成分的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1-4中任一项所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，其为Taqman荧光探针法。

8.权利要求1-4中任一项所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在鉴别蜂蜜中蜜源植物成分中的应用。