CN103031381B - 香蕉穿孔线虫lamp特异性检测方法 - Google Patents

香蕉穿孔线虫lamp特异性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)分子检测，属于植物检疫领域。本发明基于香蕉穿孔线虫与其相近种序列存在差异，通过比对香蕉穿孔线虫与其相近种线虫序列差异性，设计了1组特异引物(6条)。同时，本发明提供了一组检测香蕉穿孔线虫的LAMP引物组序列，还进一步提供了检测香蕉穿孔线虫的检测方法。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为香蕉穿孔线虫疫情监测及香蕉穿孔线虫病防控提供了有效的技术保障。

Description

香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测方法
一.技术领域
本发明适用于香蕉穿孔线虫检测，属生物技术领域。
二.背景技术
香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际公认的对农林业为害最重的十大植物寄生线虫之一。该线虫寄主范围广，多达250余种；为害重，对香蕉、柑橘及黑胡椒等造成毁灭性的危害；地理分布广，在世界一百多个国家和地区有分布。该线虫被包括中国在内全世界三十多个国家及区域组织列为重要检疫性有害生物。
近几年，该线虫在我国局部地区的温室和大棚的观赏植物上被发现，可能是随着观赏植物的引进传入，尽管及时发现并得到有效控制，但该线虫严重威胁我国农林业生产安全。因此，加强对该线虫的监测、检疫防控，阻止其进一步传入，至关重要。
香蕉穿孔线虫属线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目(Tylenchida)、短体线虫科(Pratylenchidae)、穿孔线虫属(Radopholus)。该线虫的传统分类鉴定主要依据形态学特征辅以测计学数据。因此该线虫的准确鉴定需要工作人员丰富的工作经验，故难以满足植物检疫工作的实际需要。
随着PCR等分子生物学技术发展及推广，越来越多的分子检测技术运用到植物有害生物检测技术中，近年来香蕉穿孔线虫种特异性PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)等检测技术不断出现，但是这些基于PCR的检测技术都需要PCR仪等昂贵设备，难以用于现场检疫，以及在一些基层监测工作中应用。
三.发明内容
本发明目的是提供一种香蕉穿孔线虫环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)快速检测方法。运用环介导等温扩增技术检测香蕉穿孔线虫的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对香蕉穿孔线虫核糖体DNA的ITS2区8个区域设计1组引物(含6条特异引物)，具有特异性高、快速等优点。检测时间只需25-30分钟。此外，该检测方法简单，不需复杂设备，因此还可用于室外监测及一线口岸现场检疫。
四.技术方案
(1)香蕉穿孔线虫DNA提取：
取线虫，置于PCR管中，液氮放置2分钟，加入1μl蛋白酶K(1mg/ml)，65℃15分钟，95℃以上水处理10分钟，所得即为线虫DNA提取液；
(2)香蕉穿孔线虫LAMP检测特异引物：
Rs-3F3：5′-GACTTGATGAGCGCAGAC-3′
Rs-3B3：5′-ACGCATTCATGTACGCAT-3′
Rs-3FIP：5′-AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3′
Rs-3BIP：5′-CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3′
Rs-3LF：5′-TACGAGCCGAGTGATCCA-3′
Rs-3LB：5′-GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3′
(3)香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应体系
PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20μl：
(4)香蕉穿孔线虫荧光观察检测反应体系
PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20μl：
Figure BDA00002602553000032
(5)香蕉穿孔线虫LAMP检测反应程序
63℃条件下，反应25分钟后，观察反应管中反应液浊度或颜色变化。
(6)香蕉穿孔线虫LAMP检测结果判定
香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应体系反应25分钟后，观察反应管中反应液浊度，其中反应液出现浑浊，为阳性扩增，该样品检测香蕉穿孔线虫结果为阳性，对照阴性为澄清，无浑浊(见图1)。
香蕉穿孔线虫荧光观察检测反应体系反应25分钟后，观察反应管中反应液颜色变化，其中反应液为绿色，为阳性扩增，该样品检测香蕉穿孔线虫结果为阳性，对照阴性为黄色(见图2)。
五.附图说明
图1为香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应：1，2：香蕉穿孔线虫检测样，3：穿刺短体线虫检测结果，4：空白对照。
图2为香蕉穿孔线虫荧光观察检测反应：1，2：香蕉穿孔线虫检测样，3：穿刺短体线虫检测结果，4：空白对照。
六.具体实施方式
实施例1：测试样本DNA提取：
搜集自国内外不同地区来源的由中国检验检疫科学研究院植物线虫检疫实验室保存的香蕉穿孔线虫6个群体(Rs101，Rs102，Rs103，Rs104，Rs 105，RsFJ)，其他线虫群体6个(PP101，Psp101，PspBj01，Pspbj03，Pspbj05，D34，Pspcq)，以及香蕉和红掌DNA各1份。
线虫DNA提取：线虫置于PCR管中，液氮放置2分钟，加入1ml蛋白酶K(1mg/ml)，65℃15分钟，95℃以上水处理10分钟，所得即为线虫DNA提取液；
香蕉及红掌叶片DNA提取：使用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA。
实施例2：香蕉穿孔线虫LAMP检测特异引物：
下列引物由Invitrogen生物技术公司(北京)合成。
Rs-3F3：5′-GACTTGATGAGCGCAGAC-3′
Rs-3B3：5′-ACGCATTCATGTACGCAT-3′
Rs-3FI：5′-AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3′
Rs-3BIP：5′-CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3′
Rs-3LF：5′-TACGAGCCGAGTGATCCA-3′
Rs-3LB：5′-GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3′
上述引物均根据反应体系需要用灭菌去离子水溶解成适宜浓度。
实施例3：香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应体系：
PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20μl：
Figure BDA00002602553000051
其中2×反应缓冲液的成分为：
Figure BDA00002602553000052
Figure BDA00002602553000061
实施例4：香蕉穿孔线虫荧光观察检测反应体系：
PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20μl：
Figure BDA00002602553000062
其中2×Reaction buffer的成分如(3)
实施例5：香蕉穿孔线虫LAMP检测反应程序：
按照上述体系混好，于63℃条件下，温育25分钟。
实施例6：香蕉穿孔线虫LAMP检测结果判定
香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应体系反应25分钟后，观察反应管中反应液浊度，其中反应液出现浑浊，为阳性扩增，该样品检测香蕉穿孔线虫结果为阳性，对照阴性为澄清，无浑浊(见图1)。
香蕉穿孔线虫荧光观察检测反应体系反应25分钟后，观察反应管中反应液颜色变化，其中反应液为绿色，为阳性扩增，该样品检测香蕉穿孔线虫结果为阳性，对照阴性为黄色(见图2)。

Claims (6)

1.一组香蕉穿孔线虫LAMP检测用特异引物，其核苷酸序列为： 
Rs-3F3：5′-GACTTGATGAGCGCAGAC-3′ 
Rs-3B3：5′-ACGCATTCATGTACGCAT-3′ 
Rs-3FIP：5′-AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3′ 
Rs-3BIP：5′-CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3′ 
Rs-3LF：5′-TACGAGCCGAGTGATCCA-3′ 
Rs-3LB：5′-GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3′。
2.一种检测香蕉穿孔线虫的浊度观察检测方法：其以总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行LAMP扩增，反应25分钟后观察反应液浑浊度变化。 
3.一种检测香蕉穿孔线虫的荧光观察检测方法：其以总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行LAMP扩增，反应25分钟后观察反应液颜色变化。 
4.如权利要求2所述的方法，香蕉穿孔线虫浊度观察检测方法检测25分钟后，阳性检测结果为反应液为浑浊，而阴性结果为澄清。 
5.如权利要求3所述的方法，香蕉穿孔线虫荧光观察检测方法检测25分钟后，阳性检测结果为反应液为绿色，而阴性结果为黄色。 
6.一种试剂盒，其含有权利要求1所述引物。 
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