CN101984076A

CN101984076A - 用于鱼翅pcr-rflp鲨鱼种类鉴别的引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN101984076A
Application number: CN 201010567610
Authority: CN
Inventors: 黄文胜; 韩建勋; 邓婷婷; 陈颖
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: CN101984076B

Abstract

本发明涉及用于不同种属鲨鱼鱼翅区分的寡核苷酸引物。本发明还涉及用于不同种属鲨鱼鱼翅区分的PCR-RFLP检测方法，所述方法包括使用本发明的寡核苷酸引物。本发明还涉及用于不同种属鲨鱼鱼翅区分的PCR-RFLP检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明的寡核苷酸引物。本发明还涉及所述寡核苷酸引物在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。使用本发明的寡核苷酸引物、检测试剂盒和PCR-RFLP检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地测定不同种属鲨鱼鱼翅。

Description

用于鱼翅PCR-RFLP鲨鱼种类鉴别的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于不同种属鲨鱼鱼翅区分的寡核苷酸引物、试剂盒、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis，PCR-RFLP)检测方法，以及所述寡核苷酸引物在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。

背景技术

鱼翅，海产烹饪原料，又称鲛鲨翅、沙鱼翅、金丝菜，是一种由软骨鱼系鲨鱼或犁头鳐的鳍经加工而制成的产品，主要以鳍中的软骨(又称翅筋、翅针)供食，包括背鳍、胸鳍、腹鳍、臀鳍、背鳍、尾鳍。

鱼翅种类甚多，南北名称很不一致，尚无一个统一的分类。通常的分类方法有三种：一、按鱼鳍部位分类；二、按加工与否和加工品的形状分类；三、按鲨鱼的品种分类。下面主要介绍按鲨鱼的品种分类：

(1)披刀翅、青翅、勾尾翅、勾尖翅：用日本翅鲨、黑印真鲨、沙拉真鲨、扩口真鲨和大青鲨的鳍制成，如大青鲨、澳洲半沙条鲨；

(2)象耳白翅：以三铎锥齿鲨的鳍制成，如尖吻斜锯牙鲨、加勒比斜锯牙鲨；

(3)猛鲨翅、猛鲨青翅、猛鲨尾翅：以老鼠鲨、蒙鲨、昂鲨的鳍制成，如尖吻鲭鲨；

(4)脊披刀翅、反白青翅、脊勾尾翅：以双髻鲨的鳍制成，如路氏双髻鲨；等等。

由于我国相关食品法规的不完善和检测手段的相对落后，如何规范市场秩序，打击掺杂掺假以及以次充好的商业欺诈行为，为消费者提供良好的食品安全保障手段，是当前众多学者研究的热点与难点。目前鱼翅产品缺乏相关标准、规范，执法困难，许多不法企业趁机谋取暴利。截止现在，未见有成熟的鱼翅真伪鉴别的方法。当前主要依靠个人经验，通过眼看、手摸、口尝等感官方法进行鱼翅的真伪鉴别，使检测结果的准确性及精确性大打折扣。PCR-RFLP技术作为一种分子生物学技术，从基因水平分析食品的真伪，不受环境、取材部位、时间等因素的影响，而且信息量大，可以用来区分形态标记难以鉴别的细微差异，准确、快速。PCR-RFLP技术在鱼翅制品中鲨鱼种类的鉴别尚未有过报道。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测不同种属鲨鱼鱼翅的方法。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的不同种属鲨鱼鱼翅的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供用于快速鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的寡核苷酸引物。

本发明的另一个目的在于，提供快速鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法。

本发明的再一个目的在于，提供用于快速鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供本发明所述寡核苷酸引物在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于PCR-RFLP方法鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的寡核苷酸引物对。本发明的寡核苷酸引物对是根据鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16s rDNA序列设计的，所述引物对能够特异性地鉴别不同种属鲨鱼鱼翅。在一个实施方案中，所述引物对由第一对引物和第二对引物组成，其中所述第一对引物为SK-F11：CTCAGCCATCTTACCTGTGGCAAT(SEQ ID No.1)和SK-R11：CYCCTCCTGCTGGGTCAAAG(SEQ ID No.2)，所述第二对引物为：Sharkfin-F2：CTACAAACCACAAAGATATCGGCACC(SEQ ID No.3)和Sharkfin-R2：CTCCTCCTGCTGGGTCAAAGAATGTTG(SEQ ID No.4)。所述第一对引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和第二对引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的组合是发明人经多次设计、比较，并经实验测定筛选到的，该组合的引物对能够特异性地区分多种不同种属的鲨鱼。在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸引物对能够区别不同种属鲨鱼的鱼翅，例如区别大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、路氏双髻鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨等鱼翅。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供区分不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法，所述方法包括使用针对鱼翅的寡核苷酸引物对，所述引物对是根据鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16s rDNA序列而设计的。在一个实施方案中，在本发明的不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法中，所使用的寡核苷酸引物对由第一对引物和第二对引物组成，其中所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在一个优选的实施方案中，本发明的鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法还进一步包括使用特异性限制性内切酶。优选地，在本发明的PCR-RFLP方法中，所述特异性限制性内切酶为AluI。

在一个实施方案中，本发明的鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法还进一步包括提取鱼翅样品总DNA的步骤。在一个实施方案中，所述DNA提取步骤是通过巢氏PCR检测鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16S rDNA序列来测试样品总DNA的提取质量，同时其为酶切反应提供合适的模板。在一个优选的实施方案中，所述线粒体16S rDNA序列的PCR反应的第一对引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，

所述PCR扩增条件是94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，35个循环；和

第二对引物对(巢氏引物对)序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，所述PCR扩增条件是94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，20个循环。

根据本发明的一个实施方案，在所述鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的PCR-RFLP检测方法中，酶切反应条件是整个反应体系共20μL，由ddH₂O 7.5μL、10×NEB Buffer 2μL、AluI 0.5μL和PCR反应产物10μL组成，于37℃水浴2h。根据本发明的鱼翅PCR-RFLP检测方法，还进一步包括在65℃烘箱中钝化酶活10min，并在反应结束后进行4％琼脂糖电泳分析的步骤。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于快速鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于PCR-RFLP方法鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的寡核苷酸引物对和使用说明书。在本发明的试剂盒的优选实施方案中，所述寡核苷酸引物对由第一对引物和第二对引物组成，其中所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR-RFLP反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括限制性内切酶，更优选地，所述试剂盒包括限制性内切酶AluI。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的PCR扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是：对于第一对引物的PCR扩增条件是94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，35个循环；对于第二对引物(巢氏引物对)的PCR扩增条件是94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，20个循环。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的寡核苷酸引物对在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。在本发明应用的优选实施方案中，所述寡核苷酸引物对由第一对引物和第二对引物组成，其中所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒还包括限制性内切酶，更优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶AluI。

本发明以鱼翅的DNA为检测基础，根据GeneBank中已提交的鲨鱼纲和硬骨鱼类的线粒体16S rDNA序列设计引物，利用PCR-RFLP法检测样品中的不同种属鲨鱼鱼翅成分。

优选地，在本发明中使用巢式PCR进行DNA扩增。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

使用本发明的寡核苷酸引物和PCR-RFLP法能够快速、高灵敏度和高特异性地鉴别不同种属鲨鱼鱼翅。

附图说明

图1是显示用于检测样品DNA提取效果的巢氏PCR中第一轮PCR后的常规电泳结果，其中使用第一对引物进行PCR，电泳条带分别为M：分子量Marker(2000)；1.大青鲨；2.澳洲半沙条鲨；3.尖吻斜锯牙鲨；4.尖吻鲭鲨；5.加勒比斜锯牙鲨；6.路氏双髻鲨；B.空白对照(无菌水)；

图2是显示用于检测样品DNA提取效果的巢氏PCR中第二轮PCR电泳结果，使用巢氏引物对检测，电泳条带分别为M：分子量Marker(2000)；1.大青鲨；2.澳洲半沙条鲨；3.尖吻斜锯牙鲨；4.尖吻鲭鲨；5.加勒比斜锯牙鲨；6.路氏双髻鲨；B.空白对照(无菌水)；

图3是显示样品PCR-RFLP检测结果，其中电泳条带分别为M：分子量Marker(500)；1.大青鲨；2.澳洲半沙条鲨；3.尖吻斜锯牙鲨；4.尖吻鲭鲨；5.加勒比斜锯牙鲨；6.路氏双髻鲨；B.空白对照(无菌水)。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过根据鲨鱼纲和硬骨鱼类线粒体16S rDNA序列设计了不同种属鲨鱼的通用引物。

本发明的发明人对NCBI数据库鲨鱼纲中不同种属鲨鱼和硬骨鱼类的线粒体16S rDNA基因序列进行了全面的分析，基于GeneBank号AB015962.1、AJ310141.1、FJ853422.1、Y18134.1的保守序列，经ClustalW软件对比找出他们的保守序列的相同序列，以此来设计相应的引物。

经多次比对、测试和验证大量的引物对后筛选得到以下两对引物：第一轮引物：

SK-F11：CTCAGCCATCTTACCTGTGGCAAT(SEQ ID No.1)

SK-R11 CYCCTCCTGCTGGGTCAAAG(SEQ ID No.2)

第二轮引物：

Sharkfin-F2：CTACAAACCACAAAGATATCGGCACC(SEQ ID No.3)

Sharkfin-R2：CTCCTCCTGCTGGGTCAAAGAATGTTG(SEQ ID No.4)。

使用该两对引物对的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。

以下实施例2和3描述了通过本发明的PCR-RFLP方法对不同种属鲨鱼鱼翅样品进行区分。在实施例2中，例示了通过巢氏PCR方法进行鲨鱼鱼翅样本的扩增，为之后的RFLP分析提供合适的模板。在实施例3中，例示了通过使用限制性内切酶对实施例2中巢氏PCR后得到的产物进行RFLP。

实施例2

使用鲨鱼纲和硬骨鱼类通用引物对进行巢氏PCR反应，每轮PCR后，测试样品总DNA的提取质量，为之后的RFLP分析提供合适的模板。

本实施例中所使用的用于检测鲨鱼纲和硬骨鱼类的巢氏PCR反应引物对序列为：

第一轮引物由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2组成，和第二轮引物由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成。

通过检测线粒体16S rDNA序列，测试样品总DNA的提取质量，并为酶切反应提供合适的模板。本实施例中巢氏PCR的反应体系为：第一轮PCR反应条件为94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，35个循环，反应结束后进行2％琼脂糖电泳分析；第二轮PCR反应条件为94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，20个循环，反应结束后进行2％琼脂糖电泳分析。

在本实施例中，检测了6份样本：大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、路氏双髻鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨的鱼翅。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、水浴锅、普通PCR仪等

检测主要试剂：

Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液、溴化乙锭、分子量Marker(500，2000bp)均购自大连宝生物公司；琼脂糖(电泳纯)、Tris饱和酚/氯仿(体积25∶24)，购自上海生工公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、20mmol/LNa2-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl均为本实验自行配制；无水乙醇、氯仿、异丙醇均购自北京六合通公司；限制性内切酶AluI购于北京百灵克生物科技有限公司。

检测主要步骤：

1DNA提取

待测样品为：大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、路氏双髻鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨的鱼翅。

称取0.1g磨碎的样品粉末至一洁净2.0mL离心管中，加入1.5mL CTAB裂解液，65℃2h，间期不断混匀几次；8000rpm离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中，加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm离心10min，分别取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500rpm离心20min，弃上清液，加入350μL 1.2M NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500rpm离心10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500rpm离心20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500rpm离心20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

2巢氏PCR反应体系：

第一轮PCR反应：10×PCR反应缓冲液2.5μL；上下游引物(10μmol/L)各1μL；dNTPs 0.5μL；Hotstar Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL；DNA模板2μL(约50ng)，用无菌水补至总体系为25μL。

第二轮PCR反应：10×PCR反应缓冲液2.5μL；上下游引物(10μmol/L)各1μL；dNTPs 0.5μL；Hotstar Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL；DNA模板2μL(将第一轮PCR反应产物稀释10倍作为模板)，用无菌水补至总体系为25μL。

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

3巢氏PCR反应参数：

第一轮PCR反应：94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，35个循环。反应结束后进行2％琼脂糖电泳分析。

第二轮PCR反应：94℃预变性8min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，20个循环。反应结束后进行2％琼脂糖电泳分析。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1-2所示，用鲨鱼纲和硬骨鱼类通用引物扩增待测样品的DNA时均能在相应位置扩增出现明亮的电泳条带，表明所有待测样品DNA提取成功

实施例3

本实施例为通过如下试验对鲨鱼样品进行PCR-RFLP分析。

本实施例中使用的酶切物为通过实施例2中所述巢氏PCR方法获得PCR反应终产物。

通过对线粒体16S rDNA序列进行酶切反应，可以确定鲨鱼引物的特异性。整个反应体系共20μL：ddH₂O 7.5μL，10×NEB Buffer 2μL，AluI 0.5μL，PCR反应产物10μL。于37℃水浴2h；酶切完在65℃烘箱中钝化酶活10min。反应结束后进行4％琼脂糖电泳分析。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、水浴锅、普通PCR仪等

检测主要试剂：

Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液、溴化乙锭、分子量Marker(500，2000bp)均购自大连宝生物公司；琼脂糖(电泳纯)、Tris饱和酚/氯仿(体积25∶24)，购自上海生工公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、20mmol/LNa₂-EDTA)、CTAB沉淀液(5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)、1.2mol/L NaCl均为本实验自行配制；无水乙醇、氯仿、异丙醇均购自北京六合通公司；限制性内切酶AluI购于北京百灵克生物科技有限公司。

检测主要步骤：

1检测样本：大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、路氏双髻鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨鲨鱼鱼翅等巢氏PCR反应终产物。

2酶切反应体系：

整个反应体系共 20μL

ddH₂O 7.5μL

10×NEB Buffer 2μL

AluI 0.5μL

PCR反应产物 10μL。

3酶切反应参数：

于37℃水浴2h；酶切完在65℃烘箱中钝化酶活10min。反应结束后进行4％琼脂糖电泳分析

如图3所示，利用本发明的PCR-RFLP方法检测鲨鱼鱼翅的线粒体16s DNA序列时，6种鲨鱼样品等均出现清晰的不同酶切片段，充分说明本实验所建立的PCR-RFLP方法成功地区分大青鲨、尖吻斜锯牙鲨、澳洲半沙条鲨、路氏双髻鲨、加勒比斜锯牙鲨、尖吻鲭鲨6种不同种属鲨鱼的鱼翅样品。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.用于PCR-RFLP方法鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的寡核苷酸引物对，所述引物对由第一对引物和第二对引物组成，其中所述第一对引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，所述第二对引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

2.不同种属鲨鱼鱼翅区分的PCR-RFLP检测方法，所述方法包括使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对。

3.根据权利要求2所述的PCR-RFLP检测方法，所述方法进一步包括使用限制性内切酶的步骤。

4.根据权利要求2或3所述的PCR-RFLP检测方法，所述方法进一步包括使用限制性内切酶AluI的步骤。

5.鉴别不同种属鲨鱼鱼翅的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的寡核苷酸引物对和使用说明书。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括限制性内切酶。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其所述试剂盒还包括限制性内切酶AluI。

8.权利要求1所述的寡核苷酸引物对或权利要求5-7中任一项所述的试剂盒在鉴别不同种属鲨鱼鱼翅中的应用。