CN103642911B - 鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法，所述方法包括如下步骤：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示为引物，以SEQIDNO:3为探针进行PCR扩增，若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鲨鱼成分。本发明公开的试剂盒及检测方法克服了传统的感官鉴别方法所面临的难题，具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点。

Description

鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测方法，特别是涉及一种鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一种技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于产品检测之中。例如，运用PCR技术食品和饲料中的转基因、植物、芸豆、羊、鸡、鸭成分等，并制定成相关检测标准进行推广。
鲨鱼翅在民间通常以“鱼翅”简称。作为中国传统的名贵食品之一，实际是鲨鱼和某些鳐鱼鳍中的细丝状软骨，从鲨身体上割下的新鲜鱼鳍经去砂去骨干燥成片状后称为明翅，明翅煮后将细丝状软骨(翅筋)抽出，干燥成形后称为翅饼，翅筋的主要成分为胶原蛋白。在东亚各国，鱼翅为高档食品，消费量逐年提高。
但是据新闻报道饭店出售的鱼翅实际有相当一部分是假鱼翅，市场上大约四成是人造鱼翅，原料为淀粉，明胶、海藻酸钠等，成本不到10元，在饭店鱼翅动辄要到几百元甚至上千元一份，高利润使得造假鱼翅早已经形成了一条黑色的利益链，这些鱼翅从合成，到鱼翅精调制，到烧碱明胶双氧水泡制，含有大量损伤人肾脏消化系统和致癌的物质。
针对市场上鱼翅食品质量良莠不齐，掺假现象严重的现象，为了防止生产商和销售商生产、销售掺假、掺杂、伪造食品，保证食品质量，有必要寻找一种科学方法来检测鱼翅食品中的鲨鱼成分。
发明内容
基于此，有必要提供一种具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便的鱼翅食品中鲨鱼成分快速检测试剂盒及其检测方法。
一种鱼翅食品中鲨鱼成分PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的DNA为模板；
（2）以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为引物，进行PCR扩增；
（3）电泳鉴定。
在其中一个实施例中，DNA的提取包括：称取样品，粉碎，加入DNA提取缓冲液，将溶液在40～65℃下放置20～40min，加入体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，加入等体积异丙醇，4～10℃放置0.5～2小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。
在其中一个实施例中，所述每克样品与DNA提取缓冲液体积的比例为1:4～8（g:mL）。
一种鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的DNA为模板；
（2）以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为引物，SEQIDNO:3为探针，进行实时荧光PCR扩增。
在其中一个实施例中，DNA的提取包括：称取样品，粉碎，加入DNA提取缓冲液，将溶液在40～65℃下放置20～40min，加入体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，加入等体积异丙醇，4～10℃放置0.5～2小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。
在其中一个实施例中，所述每克样品与DNA提取缓冲液体积的比例为1:4～8（g:mL）。
在其中一个实施例中，步骤（2）实时荧光PCR扩增结果为样品不含鲨鱼成分时，则以步骤（1）提取的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为引物，进行PCR扩增和电泳鉴定。
本发明的另一目的在于提供一种鱼翅食品中鲨鱼成分PCR检测试剂盒，包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物。
本发明的另一目的在于提供一种鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测试剂盒，包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物，以及SEQIDNO:3所示探针。
本发明经过大量实验，先选取了能特异性检测出鲨鱼成分的目的基因片段（SEQIDNO:4229bp），再针对此目的基因，涉及了合适的引物，得到了检测试剂盒。本发明所述的鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测试剂盒、鱼翅食品中鲨鱼成分PCR检测试剂盒和相应的检测方法具有特异性强、灵敏度高、方法重现性好、检测快速简便等优点；在普通PCR检测之前通过实时荧光PCR检测，可先将待测样品筛查一遍，筛查出的一部分样品后继续采用实时荧光PCR检测，减少后续普通PCR检测的工作量，可广泛应用于鱼翅类食品中鲨鱼基因的提取、成分鉴定等方面。
附图说明
图1为实施例1实时荧光PCR曲线；
图2为实施例2PCR检测鱼翅成分琼脂糖凝胶电泳图；
图3为实施例3部分不同种类鱼翅样品特异性引物PCR琼脂糖凝胶电泳图；
图4～图6为实施例3设计的特异性引物对其他物质PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为实施例3设计的特异性引物和探针对不同种类鱼翅进行实时荧光PCR曲线图；
图8为实施例3设计的特异性引物和探针对其他物种进行实时荧光PCR曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例及附图对本发明做进一步的说明。
实施例1
实时荧光PCR方法检测是否鱼翅食品中是否含有鲨鱼成分。
发明人根据鲨鱼线粒体基因（Genbank入藏号FJ519242）的核苷酸序列，设计并合成了一段特定的DNA序列作为引物，并用该引物成功地扩增出了鱼翅及其加工食品中所含有的特异性鲨鱼DNA片段。按照本领域公知的常规方法制备引物，采取委托基因合成公司分别合成鲨鱼基因引物和探针，分别为：
SEQIDNO:1（正向引物）：5’-GCTGAACTTGGGCAACCTGGAT-3’
SEQIDNO:2（反向引物）：5’-AGGCGAGGAGGAGAAGAAATGATGG-3’；
SEQIDNO:3（探针序列）：5’-FAM-CACCAGATATAGCCTTCCCACG
-TAMRA-3’。
（一）溶液配制：
1、配制DNA提取缓冲液1L：每L溶液中含4gCTAB（十六烷基.三甲基.溴化胺）、100nmolTris·Cl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）、20mmolEDTA（乙二胺四乙酸二钠）、1.4molNaCl（氯化钠），高温消毒灭菌，后加入0.1g蛋白酶K；
2、购制ExTaqDNA聚合酶、dNTP混合液及其10倍PCR反应缓冲液。
（二）实验步骤：
1、分别将鱼翅样品与仿鱼翅样品磨碎，称取样品100mg置于2mL离心管中，加入400μLDNA提取缓冲液，将其混匀。
2、将溶液在65℃下放置20min，室温静置20分钟冷却。
3、加入总体积为600μL的苯酚、氯仿、异戊醇，其中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1，震荡或颠倒混匀，离心12,000r/min，15min。
4、将上清液移至1.5mL离心管中，加入总体积为600μL氯仿、异戊醇，其中氯仿:异戊醇的体积比为24:1，离心12,000r/min，10min。
5、将上清液移至1.5mL离心管中，加0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，4℃静置30min，离心12,000r/min，15min收集沉淀。
6、用70%乙醇清洗沉淀二次，室温离心8,000r/min，1min收集DNA。
7、去上清，待乙醇挥发完全后，100μL双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，-20℃保存。
8、紫外分光光度法检测DNA的纯度和含量：在石英比色皿中加入50μL按10倍稀释的DNA样品(5μLDNA样品加水45μl混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A260/A280值。
9、扩增反应
实时荧光PCR：反应反应体系为20μL体系，其中10×PCR缓冲液2μL、dNTPs各0.5mM、上、下游引物各0.5μM、ExTaq酶2unit、探针0.25μM，模板DNA50ng、灭菌双蒸水补足体积至20μL。混匀后置于扩增仪上进行扩增，反应参数：95℃预变性5min后，按95℃10sec，60℃30sec程序进行40个循环。
10、结果分析，
参见图1，查看实时荧光PCR曲线，样品如有FAM荧光曲线检出，且Ct值≤36.0则判定样品含有相应的鲨鱼成分，扩增后无扩增曲线，初步判断该样品不含鲨鱼成分，需继续用普通PCR方法检测。
实施例2
普通PCR方法检测是否鱼翅食品中是否含有鲨鱼成分。
鲨鱼基因片段引物的合成：按照本领域公知的常规方法制备引物，委托引物合成公司合成成鲨鱼基因引物，分别为：
SEQIDNO:1（正向引物）：5’-GCTGAACTTGGGCAACCTGGAT-3’
SEQIDNO:2（反向引物）：5’-AGGCGAGGAGGAGAAGAAATGATGG-3’；
（一）溶液配制：
1、配制DNA提取缓冲液1L：每L溶液中含4gCTAB（十六烷基.三甲基.溴化胺）、100nmolTris·Cl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）、20mmolEDTA（乙二胺四乙酸二钠）、1.4molNaCl（氯化钠），高温消毒灭菌，后加入0.1g蛋白酶K；
2、购制TaqDNA聚合酶、dNTP混合液及其10倍PCR反应缓冲液；
3、配制上样缓冲液lL：分别称取2.5g溴酚蓝、400g蔗糖于1L容量瓶中，用水定容、混匀。
4、购置上样缓冲液DNAMarker
（二）实验步骤
1、分别将鱼翅样品与仿鱼翅样品磨碎，称取样品100mg置于2mL离心管中，加入800μLDNA提取缓冲液，将其混匀。
2、将溶液在40℃下放置40min，室温静置10分钟冷却。
3、加入总体积为600μL的苯酚、氯仿、异戊醇，其中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1，震荡或颠倒混匀，离心12,000r/min，15min。
4、将上清液移至1.5mL离心管中，加入总体积为600μL氯仿、异戊醇，其中氯仿:异戊醇的体积比为24:1，离心12,000r/min，10min。
5、将上清液移至1.5mL离心管中，加0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，10度静置2h后，离心12,000r/min，15min收集沉淀。
6、用70%乙醇清洗沉淀二次，室温离心8,000r/min，1min收集DNA。
7、去上清，待乙醇挥发完全后，100μL双蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，-20℃保存。
8、紫外分光光度法检测DNA的纯度和含量：在石英比色皿中加入50μL按10倍稀释的DNA样品(5μLDNA样品加水45μl混匀)，分别测定DNA样品在260nm和280nm处的紫外光吸收值，并计算A260/A280值。
9、扩增反应
普通PCR反应：反应体系为25μL体系，其中10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs各0.5mM、上、下游引物各0.5μM、Taq酶2unit，模板DNA50ng、灭菌双蒸水补足体积至25μL。混匀后置于扩增仪上进行扩增，反应参数：95℃预变性5min后，按95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec程序进行35个循环，最后72℃延伸5min，于4℃结束反应。
10、产物检测
（1）2%琼脂糖凝胶的制备
准确称取2g琼脂糖溶入100mL的1×TAE（0.04mol/LTris-HCl,0.02mol/LNaAC,2mmol/LEDTApH8.0）中，置微波炉上加热并不时摇动至完全熔化，室温冷至50-60℃，加20μL的10mg/mLEB立即摇匀，迅速倒入已用灭过菌的防水胶带封好口的电泳槽中，室温下放置至冷却成型，拨出梳子。
（2）电泳
将凝胶浸入电泳缓冲液中，将2μL上样缓冲液和10μLPCR反应液，充分混匀，加样至点样孔，同时加样DNAMarker作为分子量标准，接上电源，3V/cm，电泳1h。
（3）观察结果
参见图2，将凝胶置于紫外灯下观察，1-6号样品出现特异性228bp条带，为含鲨鱼成分，7-12号样品为不含鲨鱼。
实施例3
本实施例中的溶液配制、实验步骤均与上述实施例相同。
其中，部分不同种类鱼翅样品提取DNA后，用设计的鱼翅特异性引物进行PCR扩增，然后取扩增结果10μL与2μL上样缓冲液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果参见图3，1-16号样品中均扩增出特异的228bp条带，设计的引物针对鱼翅种类的普遍性良好。
将非鱼翅样品提取DNA后，用设计的鱼翅特异性引物进行PCR扩增，然后取扩增结果10μL与2μL上样缓冲液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果参见图4-图6，37种非鱼翅样品均未扩增出228bp特异性条带，说明设计的引物特异性良好。其中：M：200bpLadder；N：空白对照；P：阳性对照；1：鱿鱼；2：虾；3：鲍鱼；4：花甲；5：小黄鱼；6：三文鱼；7：金鲳鱼；8：鸡；9：剥皮牛；10：带鱼；11：土豆；12：香蕉；13：红薯；14：海蜇；15：芒果；16：海带；17：鸭；18：鹅；19：鹌鹑；20：兔；21：花生；22：牛；23：羊；24：猪；25：秋刀鱼；26：平菇；27：竹笋；28：冬瓜；29：白果；30：火龙果；31：板栗；32：玉米；33：大豆；34：小麦；35：大米；36：莲子,37：芸豆。
不同种类鱼翅样品提取DNA后，用设计的特异性引物和探针对不同种类的鱼翅进行实时荧光PCR结果参见图7，其中曲线N为空白对照，其余曲线为不同品种的鱼翅样品，可以看出样品中均有扩增荧光信号曲线产生，说明设计的引物针对鱼翅种类的普遍性良好。
设计的特异性引物和探针对非鱼翅的其他物种进行实时荧光PCR的结果参见图8，其中曲线P为正对照（鱼翅样品），曲线N为空白对照，其余曲线为非鱼翅的其他物种，可以看到只有正对照有扩增荧光信号曲线产生，其他样品均无扩增荧光信号曲线产生，说明设计的引物和探针特异性良好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的DNA为模板；
(2)以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，SEQ ID NO:3为探针，进行实时荧光PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于，DNA的提取包括：称取样品，粉碎，加入DNA提取缓冲液，将溶液在40～65℃下放置20～40min，加入体积比为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，用体积比为24:1的氯仿:异戊醇混合液进行提取；离心取上清，加入等体积异丙醇，4～10℃放置0.5～2小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA。
3.根据权利要求2所述的鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述每克样品与DNA提取缓冲液体积的比例为1:4-1:8g:ml。
4.一种鱼翅食品中鲨鱼成分实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物，以及SEQ ID NO:3所示探针。
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