CN103290103A

CN103290103A - 一种地沟油鉴定方法及其应用

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Publication number: CN103290103A
Application number: CN2012100552811A
Authority: CN
Inventors: 邓平建; 杨冬燕; 杨永存; 李�浩
Original assignee: Center Of Diseases Prevention & Control Shenzhen City
Current assignee: Center Of Diseases Prevention & Control Shenzhen City
Priority date: 2012-03-05
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种地沟油鉴定方法，该方法包括以下步骤：对待检油样进行DNA富集提取；利用聚合酶链式反应扩增富集提取得到的DNA，得到待检油样的扩增DNA片段；以多个物种特异性看家基因片段为检测指标，判断所述待检油样的扩增DNA片段是否包含多个物种特异性看家基因片段的至少一个；其中，多个物种特异性看家基因片段为非油料植物的物种特异性看家基因片段或动物特异性看家基因片段。根据本发明，以非油料植物的物种特异性看家基因片段为检测指标，保证了该检测指标的高特异性；聚合酶链式反应提高了本发明方法的检测灵敏度；DNA富集处理后待检油样中DNA提取效率显著提高；且相对于现有技术，本发明的地沟油鉴定方法具有设备成本低、检测方法简便的优点。

Description

一种地沟油鉴定方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因诊断技术，更具体地，涉及一种地沟油鉴定方法及其应用。

背景技术

地沟油，亦称“餐厨废弃油”、“潲水油”或“泔水油”，是指采用餐厨废弃物提炼产生的非食用油。提炼地沟油的原料主要来源于宾馆、酒楼剩饭、剩菜(俗称泔水)或下水道中的油腻漂浮物；劣质的猪、牛、羊肉、皮和内脏及经高温反复油炸食品使用后的老火油。地沟油中含有黄曲霉素等致癌物质且胆固醇含量过高，食用后可能导致腹痛、消化系统癌症等多种疾病。我国已明令禁止地沟油回流餐饮行业，然而，将地沟油冒充或掺入正常食用植物油中进行非法销售或使用的现象仍然存在。

大部分经提炼加工的地沟油与正常食用植物油在颜色、透明度甚至味道等感官指标上非常接近，难以通过感官直接鉴别地沟油。近年来，对冒充或掺入食用植物油的地沟油的鉴定方法的研究得到广泛开展，已见报道的鉴定方法有水分含量测定法、钠离子及金属离子含量测定法、十二烷基苯磺酸钠含量测定法、电导率、极性物质及介电常数测定法、酸价及过氧化值测定法、脂肪酸成分比例测定法、胆固醇含量测定法等。这些检测方法的检测指标各异，而且这些检测指标的特异性、稳定性及敏感度还无法满足地沟油鉴定的技术要求。总体来讲，现有方法所选择的检测指标，例如，水分、金属离子、十二烷基苯磺酸钠、电导率、极性物质、介电常数、酸价、过氧化值等，并非是地沟油特有的特征属性。仅基于上述靶标物含量的高低，并不足以鉴别地沟油与正常食用植物油，更不足以指示掺入食用植物油的地沟油，检测指标的特异性不高。此外，上述鉴定方法还普遍存在操作复杂、设备昂贵、检测成本高等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中鉴定方法的检测指标特异性不高、操作复杂、检测成本高等问题，提供一种检测指标特异性高、操作方便、检测成本低且检测灵敏度高的地沟油鉴定方法及其应用。

本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种地沟油鉴定方法，其中，所述方法包括以下步骤：

S1：对待检油样进行DNA富集提取；

S2：利用聚合酶链式反应扩增步骤S1中富集提取得到的DNA，得到待检油样的扩增DNA片段；

S3：以多个物种特异性看家基因片段为检测指标，判断所述待检油样的扩增DNA片段是否包含多个物种特异性看家基因片段的至少一个；其中，所述多个物种特异性看家基因片段为非油料植物物种特异性看家基因片段或动物特异性看家基因片段。

在上述地沟油鉴定方法中，在所述步骤S1中，采用核酸裂解液对所述待检油样进行DNA富集提取。

在上述地沟油鉴定方法中，所述采用核酸裂解液对所述待检油样进行DNA富集提取包括：按比例将所述核酸裂解液与所述待检油样混合，加热震荡，离心后弃油相，在水相中再次加入等量的所述待检油样，上述操作重复数次；保留最后一次离心后得到的水相，去除蛋白，加入核酸沉淀液，取DNA沉淀，加入核酸溶解液溶解所述DNA沉淀，制得DNA溶解液。

在上述地沟油鉴定方法中，在去除蛋白之前，将所述最后一次离心后得到的水相平均分装成多管；在加入核酸沉淀液之后，将得到的多管混合溶液转入同一沉淀管。

在上述地沟油鉴定方法中，在所述步骤S2中，所述聚合酶链式反应包括PCR和实时荧光PCR。

在上述地沟油鉴定方法中，在所述步骤S3中，所述动物特异性看家基因片段包括哺乳动物特异性看家基因片段、哺乳动物物种特异性看家基因片段和其他动物物种特异性看家基因片段。

在上述地沟油鉴定方法中，所述哺乳动物特异性看家基因片段为所有哺乳动物共有的基因片段；所述哺乳动物物种特异性看家基因片段包括猪物种特异性看家基因片段、牛物种特异性看家基因片段和羊物种特异性看家基因片段；所述其他动物物种特异性看家基因片段包括鸡物种特异性看家基因片段和鱼物种特异性看家基因片段。

在上述地沟油鉴定方法中，在所述步骤S3中，所述非油料植物物种特异性看家基因片段包括小麦物种特异性看家基因、大米物种特异性看家基因、马铃薯物种特异性看家基因、辣椒物种特异性看家基因和番茄物种特异性看家基因。

根据本发明的另一方面，提供权利要求1-8的地沟油鉴定方法在定性鉴定地沟油方面的应用。

本发明以多个物种特异性看家基因片段(非油料植物物种特异性看家基因片段或动物特异性看家基因片段)为检测指标，这种检测指标的特点在于：物种特异性看家基因片段在相应物种中高度保守，不因该物种的产地、亚种、采样部位和生长期等的不同而有所差别；另外，某一物种特异性看家基因片段不会存在于其他物种中，因此具有高度特异性。相比现有鉴定方法中选择的检测指标，本发明所选用的物种特异性看家基因片段为地沟油区别于食物油的特有属性，特异性高。本发明选用的哺乳动物特异性看家基因片段为全部哺乳动物所共有，为单拷贝或多拷贝；猪、牛和羊的物种特异性看家基因片段分别为猪、牛和羊各物种所特有，为单拷贝或多拷贝；鸡和鱼的物种特异性看家基因片段分别为鸡和鱼所特有，为单拷贝或多拷贝；非油料植物物种特异性看家基因(小麦、大米、马铃薯、辣椒、番茄的物种特异性看家基因)分别为各物种所特有，单拷贝或多拷贝。上述非油料植物物种主要是区别于作为植物油压榨来源的油料植物物种。本发明对上述多个物种特异性看家基因片段的选择主要以国内居民的饮食结构特点为基础，选择的均为实际餐饮业泔水中可能混杂的食物成分。

实施本发明的地沟油鉴定方法可以获得以下有益效果：

(1)检测指标特异性好。地沟油与正常食用植物油的区别在于其原料不同，前者以餐厨废弃物为原料，包括动物组织及非油料植物成分，后者以油料植物为原料。以餐厨废弃物为原料生产的地沟油不可避免地会混杂有动物组织及非油料植物成分。因此，以待检油样中是否含非油料植物物种特异性看家基因片段和动物特异性看家基因片段为标志鉴定地沟油，其检测指标高度特异。

(2)检测方法灵敏度高。聚合酶链式反应的检测灵敏度可以达到10拷贝。本发明的地沟油鉴定方法的检出限为6μg/kg，即：可检出每公斤油样中6μg的目标片段。

(3)DNA富集处理后待检油样中DNA提取效率显著提高。针对同一待检油样分别进行直接提取和富集提取，发现富集提取的效率可提高至少50％。

(4)相对于现有技术中采用液相、气相色谱等谱学方法通过测定某种化学成分鉴定地沟油，本发明所述的地沟油鉴定方法具有设备成本低、检测方法简便的优点。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，应该理解的是，此处的具体实施例仅用于解释目的，而不会对本发明作出任何限制。

本发明的地沟油鉴定方法涉及质量控制。质量控制的具体操作是在富集提取DNA及聚合酶链式反应过程中，除检测待检油样外，同时设置3类质控样品，即阳性对照样品、阴性对照样品及空白对照样品。阳性对照样品指已确定为地沟油的油样；阴性对照样品指已确定是非地沟油的油样；空白对照样品指去离子水。3类质控样品与待检油样同步进行完全相同的操作。而待检油样在各环节均设置至少2个平行样。

实施例1：

1.1.实验样品

待检油样：深圳市宝安公安局委托检测的疑似地沟油样品3个，3个待检油样分别编号为1、2和3。阳性对照样品：国家疾控中心提供的地沟油样品；阴性对照样品：购自深圳沃尔玛超市的色拉调和油；空白对照样品：去离子水。

1.2主要试剂和仪器设备

CTAB裂解液、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、Tris-EDTA溶液、荧光PCR试剂盒(大连宝生物公司)、离心机(德国Eppendorf)、荧光PCR扩增仪(美国ABI7500)。

1.3核酸富集处理及提取

采用核酸裂解液对待检油样进行DNA富集提取，具体操作如下：将5mL2％CTAB裂解液加入50mL离心管中，加入35mL待检油样混匀后，45℃、250rpm震荡1h，10000rpm离心5min，去油相，在水相中再加入35mL待检油样，重复上述操作6次，将第6次离心后保留的水相以每管600μL分装于2mL离心管。每管加入等体积三氯甲烷-异戊醇(24∶1)，充分混匀，4℃、12000rpm离心5min。取上层透明液体于2mL离心管中，加入2.5倍体积的核酸沉淀液(实施例1中为冷无水乙醇)，混匀，-20℃放置20min。将其中一管以10000rpm离心2min沉淀DNA后，弃液。将其余各管中的液体依次加入该管，重复离心，弃液，直至所有各管中的DNA全部沉淀于该管。用400μL 70％乙醇洗两次后，风干，用100μL核酸溶解液(实施例1中为Tris-EDTA溶液)溶解DNA沉淀，制得DNA溶解液。

1.4聚合酶链式反应

目前的聚合酶链式反应包括PCR及实时荧光PCR两种方式。两者均可实现基因片段的快速体外复制，区别在于：PCR的试剂体系中不需要加入探针，但检测灵敏度较实时荧光PCR略低；实时荧光PCR的试剂体系中需要加入探针，但检测灵敏度较PCR略高。本发明所涉及的聚合酶链式反应可以是两种方式中的任何一种。但无论采用PCR还是实时荧光PCR，均应合理控制试剂体系中加入的DNA溶解液的体积，避免加入的DNA溶解液量过少而无法有效扩增。

实施例1采用实时荧光PCR方法：采用20μL实时荧光PCR试剂体系，按试剂盒说明书配制PCR试剂体系，其中含0.54μL引物(浓度为30μmol/L)、0.2μL探针(浓度为30μmol/L)及8μL DNA溶解液。所使用的引物及探针序列信息见表1及序列表。实时荧光PCR扩增条件：95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火与延伸30s，循环40次。

表1荧光PCR扩增引物及探针序列

1.5检测结果

实时荧光PCR的试剂体系中加有探针，其检测灵敏度高，且检测结果便于分析与观察。实施例1中，若荧光PCR扩增仪判断所扩增的目标片段为阳性，则认为该实验样品内包含所选取的检测指标的基因片段(阳性结果)；否则，则为阴性结果。本发明中，地沟油鉴定方法的结果判定依据为，当同时具备以下2个条件则可判定待检油样为地沟油：(1)3类质控样品结果正常，即：阳性对照样品结果为阳性，阴性对照样品及空白对照样品结果为阴性；(2)所检测的多个物种特异性看家基因片段中的任何一个或多个在待检油样中检测结果为阳性。

表2实施例1中各样品的检测结果

1.6检测结论

根据1.5中所述地沟油鉴定方法的结果判定依据，由于待检油样1中鸡特异性12SrRNA基因和哺乳动物12SrRNA基因为阳性，而待检油样3中猪特异性12SrRNA基因、哺乳动物12SrRNA基因和大米特异性GOS9基因为阳性，因此得出待检油样1和3为地沟油检测阳性，而由于任一种物种特异性看家基因在待检油样2中均为阴性，因此待检油样2为地沟油检测阴性。

虽然实施例1中选用CTAB裂解液，但本发明也可选用任何适合的核酸裂解液，用于DNA富集提取。另外，对某一特定物种而言，其物种特异性基因片段并不是唯一的。换言之，除以上选择的作为检测指标的物种特异性基因片段以外，也可选择相应物种的其他物种特异性基因片段，例如，实施例2中则选用牛特异性cytb基因片段。

实施例2：

2.1待检油样：深圳市龙岗公安局委托检测的疑似地沟油样品4个，4个待检油样分别编号为4、5、6和7。阳性对照样品：国家疾控中心提供的地沟油样品；阴性对照样品：购自深圳沃尔玛超市的花生油；空白对照样品：去离子水。

2.2主要试剂和仪器设备

DNeasy Plant Mini Kit核酸提取试剂盒(德国QIAGEN公司)、PCR试剂盒(大连宝生物公司)、离心机(德国Eppendorf)、PCR扩增仪(美国MJRPTC-220)。

2.3核酸富集处理及提取

采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行核酸富集提取，具体操作如下：将5mL Buffer AP1加入50mL离心管中，加入35mL油样混匀后，50℃、250rpm震荡1h，10000rpm离心5min，去油相，在水相中再加入35mL油样，重复上述操作8次，将第8次离心后保留的水相以每管600μL分装于2mL离心管；每管加入130μL Buffer AP2后，按试剂盒的操作说明继续处理，直至上白色柱，将所有加了核酸沉淀液(实施例2为Buffer AP3/E)的各管液体经多次重复全部上同一白色柱收集核酸，之后按操作说明洗涤、洗脱核酸，加入核酸溶解液制得DNA溶解液。

2.4聚合酶链式反应

实施例2采用PCR方法：采用25μL的试剂体系中，按试剂盒说明书配制PCR试剂体系，其中含0.8μL引物(浓度为30μmol/L)和10μL核酸溶解液。扩增引物序列信息见表3及序列表。PCR扩增条件：95℃预变性5min、95℃变性45s、57℃退火30s、72℃延伸30s，循环40次后72℃延伸7min。取8μLPCR扩增产物(扩增DNA片段)进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

表3PCR扩增引物序列

2.5检测结果

将待检油样、阳性对照样、阴性对照样和空白对照样的PCR产物及DNAMarker同时进行凝胶电泳。若电泳实验结果显示待检油样存在与阳性对照样相同泳动速度的DNA条带，且该条带显示片段长度与根据DNAMarker判断的目标片段长度一致，同时阴性对照样和空白对照样无相应条带出现，则检测结果为阳性，认为该实验样品中含该DNA片段。否则，检测结果为阴性。本实施例使用与实施例1相同的结果判断依据。具体检测结果见表4.

表4实施例1中各样品的检测结果

2.6检测结论

根据1.5中所述地沟油鉴定方法的结果判定依据，由于待检油样4中牛特异性cytb基因、羊特异性cytb基因、猪特异性线粒体基因和大米特异性SPS基因为阳性，待检油样5中鸡特异性cytb基因和大米特异性SPS基因为阳性，待检油样7中鸡特异性cytb基因为阳性，因此得出待检油样4、5和7为地沟油检测阳性，而由于任一种物种特异性看家基因在待检油样6中均为阴性，因此待检油样6为地沟油检测阴性。

需要说明的是，本发明虽然选用小麦、大米、马铃薯、辣椒和番茄这几类非油料植物的物种特异性看家基因，但本发明并不受限于此，还可选用餐饮业中经常使用的其他种类的非油料植物的物种特异性看家基因片段。本发明虽然选用猪、牛、羊、鸡和鱼这几种动物的物种特异性看家基因片段，但本发明同样不受限于此，还可选用餐饮业中经常使用的其他种动物的物种特异性看家基因片段。另外，DNA富集提取的具体重复次数取决于待检油样精炼程度的高低，其精炼程度越高，待检油样中DNA含量越低，需要的重复次数越多。

还需要说明的是，应用本发明的地沟油鉴定方法对待检油样进行鉴定时，所选用的检测指标(物种特异性看家基因片段)越多，则可实现的检测准确度越高。本发明并不限制所使用的检测指标的数目。

Claims

1.一种地沟油鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：对待检油样进行DNA富集提取；

2.根据权利要求1所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，在所述步骤S1中，采用核酸裂解液对所述待检油样进行DNA富集提取。

3.根据权利要求2所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，所述采用核酸裂解液对所述待检油样进行DNA富集提取包括：按比例将所述核酸裂解液与所述待检油样混合，加热震荡，离心后弃油相，在水相中再次加入等量的所述待检油样，上述操作重复数次；保留最后一次离心后得到的水相，去除蛋白，加入核酸沉淀液，取DNA沉淀，加入核酸溶解液溶解所述DNA沉淀，制得DNA溶解液。

4.根据权利要求3所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，在去除蛋白之前，将所述最后一次离心后得到的水相平均分装成多管；在加入核酸沉淀液之后，将得到的多管混合溶液转入同一沉淀管。

5.根据权利要求1所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述聚合酶链式反应包括PCR和实时荧光PCR。

6.根据权利要求1所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述动物特异性看家基因片段包括哺乳动物特异性看家基因片段、哺乳动物物种特异性看家基因片段和其他动物物种特异性看家基因片段。

7.根据权利要求6所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，所述哺乳动物特异性看家基因片段为所有哺乳动物共有的基因片段；所述哺乳动物物种特异性看家基因片段包括猪物种特异性看家基因片段、牛物种特异性看家基因片段和羊物种特异性看家基因片段；所述其他动物物种特异性看家基因片段包括鸡物种特异性看家基因片段和鱼物种特异性看家基因片段。

8.根据权利要求1所述的地沟油鉴定方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述非油料植物物种特异性看家基因片段包括小麦物种特异性看家基因、大米物种特异性看家基因、马铃薯物种特异性看家基因、辣椒物种特异性看家基因和番茄物种特异性看家基因。

9.权利要求1-8的地沟油鉴定方法在鉴定地沟油方面的应用。