CN113817861B - 玉米异荭草素含量相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

玉米异荭草素含量相关的kasp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米异荭草素含量相关的KASP标记及其应用。本发明提供了一种KASP引物组，包括第一引物组和/或第二引物组；所述第一引物组由序列表中序列1所示的引物1的衍生物、序列表中序列2所示的引物2的衍生物和序列表中序列3所示的引物3组成；所述第二引物组由序列表中序列4所示的引物4的衍生物、序列表中序列5所示的引物5的衍生物和序列表中序列6所示的引物6组成。本发明能在幼苗阶段对玉米花丝异荭草素含量进行准确预测，将有助于实现高效分子辅助育种的现实目标。

Description

玉米异荭草素含量相关的KASP标记及其应用
技术领域
本发明涉及植物分子生物学，生物信息学和植物分子育种领域，具体涉及玉米异荭草素含量相关的KASP标记及其应用
背景技术
黄酮类化合物——异荭草素(isoorientin，ISO)目前被国内外广泛关注，国内外植物化合物药物研究表明其在人类抗炎症、抗氧化、抗癌细胞增值等方面具有显著效果(Mozaffarian,D.et al.Flavonoids,dairy foods and cardiovascular and metabolichealth:a review of emerging biologic pathways.Circulation Research.2018,122,369-384)，尤其值得关注的是近期发现异荭草素在抑制阿尔茨海默病致病蛋白中起重要作用(Liang,Z.B.et al.C-Glycosylflavones alleviate Tau phosphorylation andamyloid neurotoxicity through GSK3βinhibition.ACS Chemical Neuroscience,2016,7,912-923)。我们近期的实验表明，异荭草素通过调节小鼠的肠道微生物，达到抗炎症、缓解老年痴呆病理指标的功效(Zhang Z.B,et al.Isoorientin affects markers ofAlzheimer's disease via effects on the oral and gut microbiota in APP/PS1mice.Journal of Nutrition,2021,doi:10.1093/jn/nxab328)。
玉米花丝(中药名：玉米须)，作为传统的中药，已经在中医中广泛使用，有利尿消肿、清肝利胆的功效。玉米花丝异荭草素含量最高可达花丝干重的2％。因此，无论是培育富含异荭草素的玉米新品种来提取天然化合物，还是开发具有保健功能的玉米产品，都具有巨大应用前景。到目前为止，用于检测玉米花丝异荭草素含量的方法仅限于液相色谱-质谱联用技术，该技术使用的设备价格昂贵、操作复杂且检测成本高，并且只能在玉米生长至开花期后，才能剪取花丝测定异荭草素含量。到目前为止，仍缺乏有效的技术手段能在幼苗阶段对玉米花丝异荭草素含量进行准确预测。因此开发能准确预测这一复杂性状的分子标记，将有助于实现高效分子辅助育种的现实目标，符合当下加强种质资源保护利用，产业提质增效的科技发展方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供KASP分子标记引物组。
本发明提供的KASP引物组，包括第一引物组和/或第二引物组；所述第一引物组由序列表中序列1所示的引物1的衍生物、序列表中序列2所示的引物2的衍生物和序列表中序列3所示的引物3组成；所述第二引物组由序列表中序列4所示的引物4的衍生物、序列表中序列5所示的引物5的衍生物和序列表中序列6所示的引物6组成；所述序列表中序列1所示的引物1的衍生物为引物1连接显示物1，所述序列表中序列2所示的引物2的衍生物为引物2连接显示物2，且显示物1不同于显示物2；所述序列表中序列4所示的引物4的衍生物为引物4连接显示物4，所述序列表中序列5所示的引物5的衍生物为引物5连接显示物5，且显示物5不同于显示物4。
上述引物组中，所述显示物1为引物1的单链DNA分子的5'端连接的一种荧光序列(实施例具体为FAM序列标签)；所述显示物2为引物2的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列(实施例具体为HEX序列标签)。
上述引物组中，所述显示物4为引物4的单链DNA分子的5'端连接的一种荧光序列(实施例具体为FAM序列标签)；所述显示物5为引物5的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列(实施例具体为HEX序列标签)。
上述引物组中，所述引物1的衍生物、所述引物2的衍生物和所述引物3的摩尔比为2:2:5。
上述引物组中，所述引物4的衍生物、所述引物5的衍生物和所述引物6的摩尔比为2:2:5。
含有上述的引物组的PCR试剂也是本发明保护的范围。
含有上述的引物组或所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
上述引物组或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
1)鉴定或辅助鉴定玉米异荭草素含量；
2)制备鉴定或辅助鉴定玉米异荭草素含量产品；
3)检测或筛选或选育富含异荭草素的优良玉米；
4)制备检测或筛选或选育富含异荭草素的优良玉米产品。
本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定玉米异荭草素含量的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述引物组对待侧玉米进行KASP反应，检测反应产物，反应产物产生显示物2的颜色的待测玉米异荭草素含量大于反应产物产生显示物1的颜色的待测玉米；反应产物产生显示物5的颜色的待测玉米异荭草素含量大于反应产物产生显示物4的颜色的待测玉米。
本发明第3个目的是提供一种选育异荭草素含量高的玉米的方法。
本发明提供的方法，为选育上述方法得到KASP反应产物产生显示物2或显示物5的颜色的待测玉米，得到异荭草素含量高的玉米。
本发明的有益效果：
可在幼苗阶段对玉米花丝异荭草素含量进行准确预测，将有助于实现高效分子辅助育种的现实目标，符合当下加强种质资源保护利用，产业提质增效的科技发展方向。
附图说明
图1为SNP-ISO基因型与异荭草素含量分布。
图2为294份玉米花丝异荭草素含量分级情况及SNP-ISO基因型分布(2018)。
图3为294份玉米花丝异荭草素含量分级情况及SNP-ISO基因型分布(2019)。
图4为利用KASP检测107份玉米自交系SNP-ISO位点分型结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。以下实施例中所涉及实验技术或操作方法，如无特殊说明，均为本领域已知的常规实验技术或操作方法。
实施例1、玉米花丝异荭草素含量相关SNP位点的定位及分子标记
一、自然群体
本玉米自然群来源于中国农业大学杨小红教授(Li,H.,et al.Genome-wideassociation study dissects the genetic architecture of oil biosynthesis inmaize kernels.Nature Genetics,2013,45:43-50.)。该自然群体含有来自全球多地的368份玉米自交系。
二、鉴定自然群体吐丝第五天异荭草素含量
玉米自然群体种植于海南省三亚市崖州区(2018年)及湖北省荆州市(2019年)，试验重复三次，随机区组设计。正常生长的玉米自交系，当花丝吐丝第五天，分别剪取每个自交系的花丝，烘干后使用液相色谱-质谱联用技术，测定异荭草素的含量，如图1所示。
三、KASP标记的开发
使用异荭草素含量表型数据与自然群体基因组数据，经全基因组关联分析，我们在6号染色体上定位到一个超过阈值的SNP，即chr6.S_120020013(B73_RefGen_v2,P＝6.23E-07)，该SNP位于基因GRMZM2G383404(Zm00001d037384)外显子上，注释为碳糖基转移酶，推测可能是控制异荭草素含量的候选基因，命名为ZmCGT1。经烟草叶片瞬时表达实验证明，该基因编码蛋白可以催化异荭草素的合成。
为了进一步解析引起玉米自然群体花丝中异荭草素含量差异的遗传基础，我们对294份材料ZmCGT1基因的全长进行了PCR扩增并进行了一代测序。通过候选基因关联分析，发现两个显著性SNPs：A/C和A/G，分别位于玉米6号染色体120019493和120020013位点，分别命名为SNP-ISO1和SNP-ISO2；当这两个位点分别为CC和GG时，待检测玉米品种花丝中90％为异荭草素含量高(浓度>1000ug/kg)；当这两个位点为AA时，待检测玉米品种花丝中80％为异荭草素含量低(浓度<450ug/kg)。其中，高异荭草素含量的标准并非异荭草素含量的绝对值，而是基于一个涵盖了源于中国、欧美等主要玉米产区代表性种质资源的相对异荭草素含量水平。即同一气候环境条件下，测量上述种质资源的异荭草素含量，以所获取数据的最小值为基点，以(最大值-最小值)/6为步长，将待测样品按异荭草素含量高低划分成1-6级。其中1-2级为低异荭草素(<450ug/kg)，3-4级为中异荭草素(450-1000ug/kg)，5-6级为高异荭草素(>1000ug/kg)，如图2和3所示。
根据该位点及其前后40bp序列(引物P1、P2、P3针对序列表中序列7、8设计CGCCACCATGCTCTCGCTCCTTGCTTACACCCCTGTACAC[A/C]TCGACAAGAAGGCCGAGCAGGGGAGTGACATCGGCGACGT，引物P4、P5、P6针对序列表中序列9、10设计AGGGACGACAGCGCCGTGCTGACGGAATTGCTCGGCGAGG[A/G]GTTCCTGGAGCGAGTGCAGGGTCGCGGCCTCGTGACCAAG)来设计KASP引物组合，具体包括：对6号染色体120019493位点的碱基，上游两条正向引物，优选分别连接FAM(P1)和HEX(P2)荧光标记，下游一条反向引物为第P3引物；对6号染色体120020013位点的碱基，上游两条正向引物，优选分别连接FAM(P4)和HEX(P5)荧光标记，下游一条反向引物为第P6引物。
P1:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCTCGGCCTTCTTGTCGAT
P2:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCTCGGCCTTCTTGTCGAG
P3:CCATGCTCTCGCTCCTTGCTTAC
P4:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACGGAATTGCTCGGCGAGGA
P5:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGGAATTGCTCGGCGAGGG
P6:GACCCTGCACTCGCTCCAGGAA
实施例2KASP检测体系的建立及应用
具体地，每条引物用无菌水溶解并稀释至10μM，按照P1：P2：P3＝2：2：5及P4：P5：P6＝2：2：5比例混合为引物混合液备用。
一、SNP分型检测方法
1)配制PCR反应体系并进行扩增反应：
采集玉米幼嫩叶片，利用高效植物基因组DNA提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取基因组DNA，使用Nano Drop2000测定DNA浓度，并将DNA稀释成30ng/μL；检测时所用的PCR反应体系如表1(2×PCR MIX是具有AS-PCR检测能力的试剂盒)：
表1
PCR扩增程序：SNP位点检测使用一组包括两个温度步骤的热循环条件，而不是传统的三个步骤。在该方案中，DNA在较高的温度下变性，然后在一个较低的相同温度退火和延伸。具体PCR热循环条件下表所示。PCR热循环扩增可在任何合适的PCR基因扩增仪上进行。
表2
2)荧光值读取：
利用含有FAM、HEX、ROX三通道的荧光酶标仪或荧光定量PCR仪检测荧光信号并查看基因分型情况，记录荧光信号FAM、HEX读取结果。若分型不充分，则继续增加循环数，每增加5个循环查看分型情况，直至分型充分。准确记录供检样品在被检测位点的基因分型数据。在本测试方法中，使用荧光团FAM(蓝色)和HEX(红色)来区分SNP位点。被动参比染料ROX(passive reference dye ROX)用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。相关的激发和发射波长示于下表中。
表3
荧光基团 激发光(nm) 发射光(nm)
FAM 485 520
HEX 535 556
ROX 575 610
二、基因型判读
用带FAM序列标签正向引物P1、带HEX序列标签正向引物P2和反向引物P3进行KASP反应，检测KASP反应的荧光信号；反应产物产生蓝色荧光的代表基因型AA，反应产物产生红色荧光的代表基因型CC。反应产物产生蓝色荧光的玉米异荭草素含量小于反应产物产生红色荧光的玉米异荭草素含量。
同样，用带FAM序列标签正向引物P4、带HEX序列标签正向引物P5和反向引物P6进行KASP反应，检测KASP反应的荧光信号；反应产物产生蓝色荧光的代表基因型AA，反应产物产生红色荧光的代表基因型GG。反应产物产生蓝色荧光的玉米异荭草素含量小于反应产物产生红色荧光的玉米异荭草素含量，如图4所示。
三、KASP鉴定准确性分析
对上述107个玉米自交系幼嫩叶片，提取基因组DNA，根据上述方法进行基因分型。结果如表1所示，A/C和A/G中分别有101个(94％)和105个(98％)样品与重测序分型结果完全一致；分别有6个和1个样品与重测序结果不一致。由表4可见基于重测序技术与KASP技术的SNP-ISO1和SNP-ISO2位点基因分型结果比较。
表4
本发明的KASP分子标记，序列、引物明确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种中。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
上述的实施例仅是本发明的部分体现，并不能涵盖本发明的全部，在上述实施例以及附图的基础上，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下可获得更多的实施方式，因此这些不付出创造性劳动的前提下获得的实施方式均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种KASP引物组，其特征在于，包括第一引物组和/或第二引物组；所述第一引物组由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成；所述第二引物组由序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6组成。
2.根据权利要求1所述的KASP引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为2:2:5。
3.根据权利要求1所述的KASP引物组，其特征在于：所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为2:2:5。
4.含有权利要求1-3中任一所述的引物组的PCR试剂。
5.含有权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4所述的PCR试剂的试剂盒。
6.一种KASP引物组在如下1）-4）中至少一种中的应用：
所述KASP引物组由第一引物组和第二引物组组成；所述第一引物组由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成；所述第二引物组由序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6组成；
1) 鉴定或辅助鉴定玉米异荭草素含量；
2) 制备鉴定或辅助鉴定玉米异荭草素含量产品；
3) 检测或筛选或选育富含异荭草素的优良玉米；
4) 制备检测或筛选或选育富含异荭草素的优良玉米产品。
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