CN102787172A

CN102787172A - 利用ssr引物鉴定大麦品种的方法及其应用

Info

Publication number: CN102787172A
Application number: CN2012103264163A
Authority: CN
Inventors: 王艳平; 沈奇; 张继红; 李华勇; 吴燕; 王显生
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2032-09-06
Also published as: CN102787172B

Abstract

本发明涉及一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA，用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其中：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，当品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；当品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；当品种间差异位点数为0，判定为疑同品种。本发明可以用于对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定，或构建大麦品种数据库。具有高效、准确、低成本、操作方便等优势，有效的对大麦种子真伪进行监控，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场。

Description

利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其应用

技术领域

本发明涉及大麦品种鉴定方法及其应用，尤其是利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其应用，属于农业的大麦育种与应用技术领域。

背景技术

随着植物育种和种子产业的发展，植物新品种保护（Protection of New Varieties of Plant，简称PVP）作为知识产权的10种内容之一，其重要性越来越突出。培育和推广新的优良品种是我国大麦育种发展的重要方向，因此新品种的准确鉴定不仅是新品种审定和保护的前提，也为辨别假冒伪劣种子，保护自身知识产权，维护育种者的切身利益提供保障和科学依据。因此，开发高效、准确的种子品种鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

大麦是全球第四大禾谷类作物,适应性强、用途广，品种的差异直接影响大麦的生产和使用性能，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要，同时新品种的登记测试以及资源种质遗传多样性分析都需要有别于传统的形态标记田间鉴定的更加高效、准确、低成本以及操作方便的分子水平品种鉴定方法。

近年来随着分子生物学的发展，各种分子标记技术在植物品种鉴定中得到了大量应用。遗传标记经过形态标记、细胞学标记、蛋白质标记发展到DNA标记。DNA标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映，表现为核苷酸序列上的差异，因此标记在数量上几乎是无限的。与其它遗传标记相比，DNA标记还具有无表型效应，不受环境影响等优点，广泛应用到种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等方面，成为理想的快速进行种子品种鉴定的检测方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR及ISSR标记等在植物品种鉴定中都有应用。

目前我国对大麦品种进行鉴定主要方法是按照GB/T 19557.X-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大麦》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间测定，鉴定结果易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致代码判定结果不一致的问题。同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。

简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微卫星（Microsatellites）。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。目前，SSR标记也已经应用于水稻、小麦、大麦、玉米等作物的分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前对大麦品种进行鉴定方法只能在大田里进行，且工作量大，等一系列问题，提供一种新的利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其应用。

本发明的目的是这样实现的：一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其特征在于：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，所述的SSR引物包括14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物，其中，14对基本核心SSR引物为Bmag0211 、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603对应的引物，14对扩展核心SSR引物为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864对应的引物；具体步骤如下：

a)提取供试品种样品的DNA；

b)用14对基本核心SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25 μL，扩增反应体系为：SuperTaq? 5U/μL的DNA Polymerase 0.2 μL，2.5mmol/L的dNTP 2 μL，含Mg²⁺的10×PCR Buffer 2.5 μL，10 μmol/L的每对引物的上游和下游引物各1μL，供试大麦品种基因组20 ng/μL的DNA模板1 μL，双蒸水补足25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环，94℃ 30 sec，47～62℃ 30 sec，72℃ 1min，72℃ 延伸5min，4℃保存；

c)供试大麦品种PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，凝胶组分为：6%变性聚丙烯酰胺溶液60 mL，TEMED 50 μL,10% 过硫酸胺 500 μL；设定功率50 W，1×TBE缓冲液电泳 2 h，关闭电源，进行染色；染色过程是：10%冰醋酸溶液固定20 min，超纯水迅速水洗，0.2%硝酸银溶液银染30 min，超纯水再次迅速水洗，显影液显色数分钟，直至条带清晰，10%冰醋酸溶液终止5 min，超纯水再次水洗；

d)通过分析基本核心SSR结果，大麦品种间多态性位点的差异，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，利用这些数据对来源不明的大麦品种进行比较,如果品种间差异位点数≥3，判定为不同品种，形成鉴定结果；

e)如果品种间差异位点数小于2，再用14个扩展核心SSR引物对采用供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积和扩增反应体系均与b步骤相同；并按照d步骤进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染；

f)综合分析基本核心SSR和扩展核心SSR引物的结果，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；品种间差异位点数为0，判定为疑同品种，形成鉴定结果；

所述的6%变性聚丙烯酰胺溶液为420 g尿素，10×TBE 50 mL，40% PAG 150 mL，去离子水定容至1000 mL；所述的10%冰醋酸溶液是将100 mL冰醋酸，加入1000 mL去离子水；所述的0.2%硝酸银溶液是将2.0 g硝酸银，溶于1000 mL去离子水中；所述的显影液是将15 g 氢氧化钠溶于1000 mL去离子水中，再加入5 mL甲醛。

在本发明的技术方案中：提取供试品种样品的DNA是指：对来源不明的大麦品种进行随机取样，每份样品取单株5株，取幼苗叶片0.5 g混合为一个样本，剪碎，放入2 mL离心管中，往离心管中加入液氮冷冻，放入研磨仪，磨成粉状后立即加入预热的DNA提取液790～810μL，剧烈摇动混匀，并在65℃水浴中保温30～50 min，摇动使其混匀。冷却至室温加入等体积三氯甲烷和异戊醇的混合液，颠倒混匀，室温下静置5～10 min，使水相和有机相分层，12000g离心10 min，移取上清液至另一2 mL离心管中，加入约1.5倍体积的预冷乙醇，轻缓颠倒混匀，经12 000 g离心3 min至分相，弃上清液；用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入50μL 1×TE缓冲液溶解沉淀；用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20 ng/μL，置于-20℃保存备用；

其中，DNA提取液的配方为15 g SDS，pH8.0的0.5 M EDTA ，pH8.0的1 M Tris-HCl，5M NaCl；三氯甲烷和异戊醇的混合液的体积比为24:1。

一种上述方法的应用，其特征在于：通过14对基本核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定；或同时通过14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定。

上述方法的另一种应用，其特征在于：利用14对基本核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，构建大麦品种数据库，或同时利用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析构建大麦品种数据库。

本发明的优点在于：可以在实验室，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术鉴定大麦品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。

附图说明：

图1是通过14对基本核心SSR引物完成大麦品种鉴定的电泳图。

图2和图3均是通过14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物完成大麦品种鉴定的电泳图。

图4为14对基本核心SSR引物用于48份大麦品种扩增SSR谱带分析的品种聚类图。

图5为14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物用于48份大麦品种扩增后SSR谱带分析的品种聚类图。

具体实施方式

实施例1

通过分析，在已公布序列的在大麦品种中具有多态性的153对SSR引物中确定14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物：

14对基本核心SSR为Bmag0211 、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603。

14对扩展核心SSR为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864。

针对14对基本核心SSR和14对扩展核心SSR通过http://www.graingenes.org网站获取与所述SSR对应的上游引物和下游引物（见表1）：

表1 引物序列表如下：

Figure 2012103264163100002DEST_PATH_IMAGE002

引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例2

样品包括2份供试大麦品种，其中一份为未知大麦品种自编号B1(下称B1)，另一份为对照品种苏啤5号，2份供试大麦品种的产地均为江苏省。

试剂：

上海浦迪生物科技有限公司生产的SuperTaq? DNA Polymerase(5U/μL)、dNTP（2.5mmol/L）、10×PCR Buffer(含Mg²⁺）；上海英骏生物技术有限公司合成的I套SSR基本核心引物。

取样及DNA提取：

对来样进行随机取样。每份样品取单株5株，取幼苗叶片0.5 g混合为一个样本，剪碎，放入2 mL离心管中，往离心管中加入液氮冷冻，放入研磨仪，磨成粉状后立即加入预热的DNA提取液（15 g SDS，0.5 M EDTA（pH8.0），1 M Tris-HCl（pH8.0），5 M NaCl）800 μL左右，剧烈摇动混匀，并在65℃水浴中保温30～50 min，其间可摇动几次。冷却至室温加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24:1），颠倒混匀，室温下静置5～10 min，使水相和有机相分层。12 000 g离心10 min。移取上清液至另一2 mL离心管中，加入约1.5倍体积的预冷乙醇，轻缓颠倒混匀，经12 000 g离心3 min至分相，弃上清液。用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入50μL 1×TE缓冲液溶解沉淀。用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20 ng/μL。置于-20℃保存备用。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

PCR反应

按表1所述的PCR扩增14对基本核心SSR引物对未知大麦品种B1和对照品种苏啤5号模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25 μL，扩增反应体系为：SuperTaq? DNA Polymerase(5U/μL)0.2 μL，dNTP（2.5mmol/L） 2 μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺）2.5 μL，每对引物的上游和下游引物（10 μmol/L）各1μL，供试大麦品种基因组DNA模板（20 ng/μL）1 μL，双蒸水补足25μL。PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，47～62℃(根据表1中推荐的SSR引物退火温度而定）30 sec，72℃ 1min），72℃ 延伸5min，4℃保存。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

供试品种PCR产物上样3～5μL，设定功率50 W，1×TBE缓冲液电泳 2 h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定20 min，迅速水洗，银染30 min，再次迅速水洗，NaOH显影液显色数分钟，直至条带清晰，终止5 min，再次水洗。电泳图如图1。

在图1中，单数泳道为大麦品种B1，双数泳道为大麦品种苏啤5号,同时，1、2泳道为Bmag0211引物，3、4泳道为Bmag0378，5、6泳道为Bmag0711，7、8泳道为Bmac0209，9、10泳道为Bmag0877，11、12泳道为EBmac0701，13、14泳道为EBmac0635，15、16泳道为Bmag0353，17、18泳道为Scssr10148，19、20泳道为Scssr03907，21、22泳道为Bmag0009，23、24泳道为Bmag0867，25、26泳道为HVCMA，27、28泳道为EBmac0603。

SSR结果分析

利用基本核心SSR引物对未知大麦品种B1和对照品种苏啤5号进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出基本核心SSR引物对2份大麦品种的SSR分析谱带数据。从所得的电泳图谱可以看出，这2份大麦品种在Bmac0209、Bmag0353、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA 6个位点上存在差异，说明基本核心SSR引物可以把这2份大麦品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的大麦品种鉴别方法，可以有效地对大麦种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

实施例3

本实施例的步骤和方法与实施例2相同，它与实施例2的区别仅在于：所述的样品一份为未知大麦品种自编号B2(下称B2)，另一份为对照品种苏啤3号（产地均为江苏省）。

PCR反应是按照表1所述的14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物对未知大麦品种B2和对照品种苏啤3号模板DNA进行PCR扩增。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的电泳图为图2，在图2中，单数泳道为大麦品种B2，双数泳道为大麦品种苏啤3号,同时，1、2泳道为Bmag0211引物，3、4泳道为Bmag0378，5、6泳道为Bmag0711，7、8泳道为Bmac0209，9、10泳道为Bmag0877，11、12泳道为EBmac0701，13、14泳道为EBmac0635，15、16泳道为Bmag0353，17、18泳道为Scssr10148，19、20泳道为Scssr03907，21、22泳道为Bmag0009，23、24泳道为Bmag0867，25、26泳道为HVCMA，27、28泳道为EBmac0603，29、30泳道为Scssr02748，31、32泳道为HVM54，33、34泳道为Scssr07759，35、36泳道为HvXan，37、38泳道为HVM27，39、40泳道为HVM60，41、42泳道为HVM40，43、44泳道为Bmac0181，45、46泳道为Scssr07106，47、48泳道为Bmag0387，49、50泳道为Bmac0018，51、52泳道为Scssr09398，53、54泳道为Bmac0064，55、56泳道为Scssr15864。

SSR结果分析

同时利用基本核心SSR引物和扩展核心SSR引物对未知大麦品种B2和对照品种苏啤3号，进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出基本核心SSR引物和扩展核心SSR引物对2份大麦品种的SSR分析谱带数据。从所得的电泳图谱可以看出，这2份大麦品种在基本核心SSR引物Bmag0353和扩展核心SSR引物Bmac0064、Scssr15864 3个位点上存在差异，说明基本核心SSR引物和扩展核心SSR引物可以把这2份大麦品种完全区分开，利用这样一套高效、低成本、操作方便的大麦品种鉴别方法，可以有效地对大麦种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

实施例4

本实施例的步骤和方法与实施例3相同，它与实施例3的区别仅在于：样品为未知大麦品种自编号B3(下称B3)，另一份为对照品种盐农啤1号（均为江苏省）。

PCR反应是按照表1所述的14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物对未知大麦品种B3和对照品种盐农啤1号模板DNA进行PCR扩增。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的电泳图为图3，在图3中，单数泳道为大麦品种B3，双数泳道为大麦品种盐农啤1号,同时，1、2泳道为Bmag0211引物，3、4泳道为Bmag0378，5、6泳道为Bmag0711，7、8泳道为Bmac0209，9、10泳道为Bmag0877，11、12泳道为EBmac0701，13、14泳道为EBmac0635，15、16泳道为Bmag0353，17、18泳道为Scssr10148，19、20泳道为Scssr03907，21、22泳道为Bmag0009，23、24泳道为Bmag0867，25、26泳道为HVCMA，27、28泳道为EBmac0603，29、30泳道为Scssr02748，31、32泳道为HVM54，33、34泳道为Scssr07759，35、36泳道为HvXan，37、38泳道为HVM27，39、40泳道为HVM60，41、42泳道为HVM40，43、44泳道为Bmac0181，45、46泳道为Scssr07106，47、48泳道为Bmag0387，49、50泳道为Bmac0018，51、52泳道为Scssr09398，53、54泳道为Bmac0064，55、56泳道为Scssr15864。

SSR结果分析

利用I套和II套SSR核心引物对未知大麦品种B3和对照品种盐农啤1号进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出I套和II套SSR引物2份大麦品种的SSR分析谱带数据。从所得的电泳图谱可以看出，这2份大麦品种在28个I套和II套SSR核心引物位点上没有差异，表明B3是对照品种盐农啤1号的疑同品种，须按照“GB/T 19557.X-2004 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大麦”的规定进行田间鉴定，结合田间鉴定的结果进行判定。利用这样一套高效、低成本、操作方便的大麦品种鉴别方法，可以有效地对大麦种子真伪进行监控，为新品种登记测试以及资源种质遗传性分析提供有力的技术手段。

实施例5

建立大麦品种数据库。

样品包括48份未知大麦品种，为它们的自编号分别为10、21、28、34、40、59、67、69、76、78、79、82、107、108、375、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B19、B20、B21、B22、B23、B24、B25、B26、B27、B28、B30、B46、B47、B48、B49（以下简称48份大麦品种），来源于全国不同省份。

试剂和取样及DNA提取均与实施例2~4相同。

PCR反应时，利用表1所述的14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物分别对48份大麦品种品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25 μL，扩增反应体系为：SuperTaq? DNA Polymerase(5U/μL)0.2 μL，dNTP（2.5mmol/L） 2 μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺）2.5 μL，每对引物的上游和下游引物（10 μmol/L）各1μL，供试大麦品种基因组DNA模板（20 ng/μL）1 μL，双蒸水补足25μL。PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃ 30 sec，47～62℃(根据表1中推荐的SSR引物退火温度而定）30 sec，72℃ 1min），72℃ 延伸5min，4℃保存。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，48份未知大麦品种的PCR产物上样3～5μL，设定功率50 W，1×TBE缓冲液电泳 2 h，关闭电源，进行染色；染色过程：固定20 min，迅速水洗，银染30 min，再次迅速水洗，NaOH显影液显色数分钟，直至条带清晰，终止5 min，再次水洗。

SSR结果分析。

利用I套和II套SSR引物分别对48份大麦品种进行有效扩增，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为0，构建出I套和II套SSR引物20份大麦品种的SSR分析谱带数据。从所得的数据可以看出，I套和II套SSR引物可以把这48份大麦品种完全区分开，图4为14对基本核心SSR引物用于48份大麦品种扩增SSR谱带分析的品种聚类图，图5为14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物用于48份大麦品种扩增SSR谱带分析的品种聚类图。

可见利用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物可以比较方便地建立大麦品种数据库。

以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要是利用本发明涉及的14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物，结合本领域的基本常识，在大麦种子鉴定，或用于建立大麦数据库的资料准备，都属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其特征在于：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，所述的SSR引物包括14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物，其中，14对基本核心SSR引物为Bmag0211 、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603对应的引物，14对扩展核心SSR引物为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864对应的引物；具体步骤如下：

提取供试品种样品的DNA；

用14对基本核心SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25 μL，扩增反应体系为：SuperTaq? 5U/μL的DNA Polymerase 0.2 μL，2.5mmol/L的dNTP 2 μL，含Mg²⁺的10×PCR Buffer 2.5 μL，10 μmol/L的每对引物的上游和下游引物各1μL，供试大麦品种基因组20 ng/μL的DNA模板1 μL，双蒸水补足25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环，94℃ 30 sec，47～62℃ 30 sec，72℃ 1min，72℃ 延伸5min，4℃保存；

供试大麦品种PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，凝胶组分为：6%变性聚丙烯酰胺溶液60 mL，TEMED 50 μL,10% 过硫酸胺 500 μL；设定功率50 W，1×TBE缓冲液电泳 2 h，关闭电源，进行染色；染色过程是：10%冰醋酸溶液固定20 min，超纯水迅速水洗，0.2%硝酸银溶液银染30 min，超纯水再次迅速水洗，显影液显色数分钟，直至条带清晰，10%冰醋酸溶液终止5 min，超纯水再次水洗；

通过分析基本核心SSR结果，大麦品种间多态性位点的差异，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，利用这些数据对来源不明的大麦品种进行比较,如果品种间差异位点数≥3，判定为不同品种，形成鉴定结果；如果品种间差异位点数小于2,则转入e步骤；

再用14个扩展核心SSR引物对采用供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积和扩增反应体系均与b步骤相同；并按照d步骤进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染；

综合分析基本核心SSR和扩展核心SSR引物的结果，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；品种间差异位点数为0，判定为疑同品种，形成鉴定结果；

所述的6%变性聚丙烯酰胺溶液为420g尿素，10×TBE 50 mL，40% PAG 150 mL，去离子水定容至1000 mL；所述的10%冰醋酸溶液是将100 mL冰醋酸，加入1000 mL去离子水；所述的0.2%硝酸银溶液是将2.0 g硝酸银，溶于1000 mL去离子水中；所述的显影液是将15 g 氢氧化钠溶于1000 mL去离子水中，再加入5 mL甲醛。

2.根据权利要求1所述的利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，其特征在于：提取供试品种样品的DNA是指：对来源不明的大麦品种进行随机取样，每份样品取单株5株，取幼苗叶片0.5 g混合为一个样本，剪碎，放入2 mL离心管中，往离心管中加入液氮冷冻，放入研磨仪，磨成粉状后立即加入预热的DNA提取液790～810μL，剧烈摇动混匀，并在65℃水浴中保温30～50 min，摇动使其混匀。

3.冷却至室温加入等体积三氯甲烷和异戊醇的混合液，颠倒混匀，室温下静置5～10 min，使水相和有机相分层，12000g离心10 min，移取上清液至另一2 mL离心管中，加入约1.5倍体积的预冷乙醇，轻缓颠倒混匀，经12 000 g离心3 min至分相，弃上清液；用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加入50μL 1×TE缓冲液溶解沉淀；用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20 ng/μL，置于-20℃保存备用；

其中，DNA提取液的配方为15 g SDS，pH8.0的0.5 M EDTA ，pH8.0的1M Tris-HCl，5M NaCl；三氯甲烷和异戊醇的混合液的体积比为24:1。

4.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：通过14对基本核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定；或同时通过14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定。

5.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：利用14对基本核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，构建大麦品种数据库，或同时利用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析构建大麦品种数据库。