CN107345934A - 一种长牡蛎微卫星聚丙烯酰氨凝胶电泳的快速银染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于长牡蛎的微卫星聚丙烯酰胺凝胶电泳的快速银染方法，所述方法包括以下步骤：聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在染液中3min；将凝胶放入蒸馏水中冲洗10s；随后取出凝胶，放入显影液中4min；将显影成功的胶冲洗干净。将传统的固定、三次冲洗、染色、显影、定影、冲洗等6个步骤缩减为四个步骤，染色液与显影液可反复使用3次，同时银染效果也得到了保证，与传统方法相比大大节省了时间与成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产动物的聚丙烯酰胺凝胶电泳的快速银染法。
背景技术
长牡蛎(Crassostrea gigas)是我国乃至世界上最重要的经济贝类之一。虽然传统选育工作已经积极开展，但我国长牡蛎的遗传基础仍然为野生型。缺乏良种、单产低等问题严重影响长牡蛎养殖业的发展。因此，亟需培育出产量高、品质好的长牡蛎优良品种，保证长牡蛎养殖产业的可持续健康发展。随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记辅助选择育种和种群多样性研究成为一种有效的方法，为优良品种的快速培育提供了技术保障。目前，结合分子标记辅助育种技术，培育出生长快、品质好的新品种对于实现牡蛎养殖业健康可持续发展具有重要意义。
微卫星标记是一种共显性的分子标记，具有变异程度高，在基因组中分布广泛，符合孟德尔遗传，易于PCR扩增等特点，是最常使用的分子标记之一，已成功应用在水产动物的遗传育种等领域。微卫星标记作为分子遗传学研究的有利手段，为长牡蛎遗传多样性监测、家系鉴定、遗传图谱构建及QTL定位等研究提供了有力工具。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称为PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为介质的一种常用电泳技术，其结合银染法进行标记检测，是分子生物学和基因工程研究上不可缺少的实验技术。基于银染法的聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测灵敏度和分辨率都比较高，特别适合于微卫星标记扩增产物的检测。微卫星标记的传统分析方法是对每个标记的PCR扩增产物在变性或者非变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。银染的原理是首先用固定剂将核酸分子固定到凝胶上，然后使银染剂中的银离子与之牢固结合，再通过还原剂将银离子还原，从而发生银棕色显色反应。然而，聚丙烯酰胺凝胶银染的常规方法操作繁琐、耗时长，染色方法的改良可以更加行之有效、简便快捷的应用于长牡蛎微卫星分子标记分析。
发明内容
基于传统聚丙烯酰胺凝胶银染法操作繁琐、耗时长的缺陷，对染色方法的改进可以节约时间并降低成本。
本发明具体的技术方案如下：
1、电泳完成后，将凝胶放入染色液中进行染色；
2、将凝胶从染色液中取出，用去离子水冲洗干净；
3、将凝胶放入显影液中；
4、将显影完成的凝胶冲洗干净；
5、烘干读数。
本发明有下述几方面优点：
将传统方法的固定、三次冲洗、染色、显影、定影、冲洗等6个步骤缩减为四个步骤，相比于传统方法所需要的1小时30分钟缩减为10分钟之内，而且染色液和显影液均可重复利用3次。
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
附图说明：
图1显示为长牡蛎微卫星标记快速银染法的显色效果。
实施例1：
（1）使用苯酚氯仿法提取长牡蛎的DNA。
（2）用常规的微卫星标记进行PCR扩增反应
PCR扩增程序为：94℃ 2 min；94℃变性45s，退火45s（不同引物退火温度不同），72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10s，12℃保存。
（3）取PCR产物加等体积变性剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（4）聚丙烯酰氨凝胶的银染
聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在染液（0.2%硝酸银，0.5%醋酸）中3min；将凝胶放入蒸馏水中冲洗10 s；随后取出凝胶放入显影液（1%氢氧化钠，0.4%甲醛）中4min，显色完成。最后，将凝胶放入蒸馏水中冲洗干净（2min），晾干读带。染液与显影液均可重复使用3次。
通过该银染方法来处理聚丙烯酰胺凝胶，具有条带显色良好，条带清晰，操作时间短且程序简单，染色液及显影液容易保存等优点，是一种及其为理想的染色放大。本发明的银染过程可在10 min内完成，且染色液与显影液均可使用3次，显著提高了实验效率，节省实验成本。
Claims (4)
1.一种用于长牡蛎微卫星聚丙烯酰氨凝胶电泳的快速银染方法，步骤如下：
将电泳好的PAGE胶，放入染液染色3min；将从染液中取出的胶放入蒸馏水中冲洗10s；将从蒸馏水中取出的胶放入显影液中4min，将显影完成的胶用蒸馏水冲洗干净。
2.依据权利要求１所述的微卫星聚丙烯酰氨凝胶电泳的快速银染检测方法，其特征是：染液为0.2%硝酸银，0.5%醋酸。
3.依据权利要求１所述的微卫星聚丙烯酰氨凝胶电泳的快速银染检测方法，其特征是：显影液为1%氢氧化钠，0.4%甲醛。
4.依据权利要求１所述的微卫星聚丙烯酰氨凝胶电泳的快速银染检测方法，其特征是：染液与显影液均可用3次。
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