CN111593128B

CN111593128B - 一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用方法

Info

Publication number: CN111593128B
Application number: CN201911392151.5A
Authority: CN
Inventors: 许愿; 狄生伟; 宁方勇; 白秀娟; 杜智恒; 刘珈羽; 苏杭; 徐逸男; 吕晶
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2024-06-11
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111593128A

Abstract

本发明提供一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记。其主要特征是，提取东北林蛙脚趾组织的基因组，以提取的基因组DNA为模板，以含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对进行PCR扩增反应。通过14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列（222bp）对应条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO:3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。本发明其优点是，获得了东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，可快速、简便、准确地鉴定东北林蛙的遗传性别。本发明可获得伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。利用伪雄个体与雌性个体交配，其后代生理雌性的比例高达90%以上，可显著提高东北林蛙养殖的经济效益。

Description

一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种通过分子标记鉴定东北林蛙遗传性别的方法。

背景技术

东北林蛙（Rana Dybowskii）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）蛙属（Rana）。雌性东北林蛙，即《中药大辞典》中所述的中国林蛙，干燥后的输卵管被称为哈蟆油或林蛙油，是一种久负盛名的滋补中药。研究表明，经常服用林蛙油，可补充人体所需的18种必需氨基酸，增强体力和记忆力，增强对各种疾病的免疫功能。

因为巨大的经济利益的驱使，人们长期以来对野生东北林蛙进行“灭绝式”抓捕。随着林蛙的野生资源越捕越少，个体越捕越小，而市场需求越来越大，市场价格逐年上涨，供需矛盾日益加剧，人们不得不寻求人工养殖林蛙之路。2010年，吉林省林蛙养殖产值达到15亿元。

在东北林蛙养殖过程中，养殖群体雄性比例过高这一问题严重影响了东北林蛙养殖的经济效益。东北林蛙性别分化由遗传因素决定，同时受环境因素修饰，并在变态结束前完成，此后个体生理性别不再改变。由于环境因素对东北林蛙性别分化具有修饰作用，因此东北林蛙会出现遗传性别与生理性别不一致的个体，即性逆转个体。动物的性逆转个体在单性育种中具有非常重要的作用，已经成功运用于全雄罗非鱼和高雌半滑舌鳎等鱼类的单性生产中。东北林蛙的生理性别可以通过外部形态观察得以鉴定，但由于东北林蛙核型分析中未能观察到异型性染色体，所以无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定，从而无法成功获得性逆转个体。

性别特异性DNA分子标记是物种遗传性别鉴定有效载体。因此，获取一种能够鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记是构建全雌或高雌养殖群体的关键技术之一。然而，目前尚未见东北林蛙性别特异性DNA分子标记的报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术中存在的问题，提供了一种鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记及鉴定方法。利用本发明的技术方案，可以确定东北林蛙的遗传性别。

本发明的目的是这样实现的，其特征是，按以下步骤操作：

（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，

（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。

（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带，即图2所示的方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。

（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQ ID NO :3。所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列，

GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC

本发明的有益效果

在缺少全基因组数据作为参考，且无异型性染色体的情况下，需要鉴定东北林蛙遗传性别是非常困难的。利用性别特异性DNA分子标记是一种鉴定物种遗传性别的有效途径。本发明获得了一个东北林蛙遗传雄性特异性DNA分子标记，成功地鉴定出东北林蛙的遗传性别，并确定东北林蛙的性别决定类型为XY型。在生理雄性个体中，通过本发明鉴定，我们获得了缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。

2019年春季，我们以伪雄个体为父本，以正常雌性为母本进行抱对，获得了2个受精卵团。从每个卵团取240个受精卵，在20℃件下孵化，并饲养至变态结束。通过解剖观察，鉴定变态幼蛙的生理性别。变态幼蛙生理性别雌雄比分别为：164/17和152/14，生理雌性所占比例分别为90.61%和91.57%。

此验证性试验说明，东北林蛙性逆转为伪雄的个体，其子代在20℃温度条件下均能大多数发育为生理雌性。本发明能实现对东北林蛙养殖群体性别控制，从而提高东北林蛙养殖的经济效益。

图1是本发明东北林蛙脚趾DNA的 1.2%琼脂糖凝胶电泳图

图2是本发明PCR扩增产物14%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步说明

由图1可知，本实验所提取的部分DNA琼脂糖电泳检测结果，DNA片段完整，点样孔无大量蛋白存在，DNA无明显降解，说明DNA量较高，可以满足进一步分析的需要。

由图2可知，泳道17为2000bp的marker；泳道1~16为生理雄性东北林蛙，泳道18~33为生理雌性东北林蛙。除了同时出现在雌性和雄性个体中的条带，其中泳道1,2,3,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16具有一条222bp的性别特异性条带，即图2方框内所示条带，具有此条带的个体为遗传雄性个体。此条带在所有生理雌性个体，即泳道18~33和2个生理雄性个体，即泳道4、6，中均未出现，未出现此条带的个体为遗传雌性个体。泳道4和6的个体是生理雄性个体，但无此遗传雄性特异性条带，由此判定个体4和6为性逆转的伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。

实施本发明的具体操作如下：

1. 提取东北林蛙脚趾组织的基因组

（1）样品采集，将黑龙江省小兴安岭地区东北林蛙置于搪瓷盆，经蒸馏水冲洗两遍后，剪取左后肢趾尖，放入1.5ml离心管，加75%乙醇，-20℃保存备用。

（2）实验试剂

Tris-饱和酚、无水乙醇、70%乙醇；

消化液：由pH8.0 Tris-HCI 100mmol/L， pH8.0 EDTA 5mmol/L， 200mmol/LNaCI，0.2%SDS，0.1mg/mL蛋白酶K组成；

TE缓冲液：由10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA组成，pH8.0；

酚/氯仿/异戊醇混合液：酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1；

氯仿/异戊醇混合液：氯仿、异戊醇体积比为24:1；

（3）实验步骤

a. 取适量样品，于滤纸上晾干乙醇，置于1.5ml EP管中，用小剪刀将样品剪碎。平置EP管，至样品中乙醇挥发完毕；

b. EP管中加入500μl裂解液，扣上盖，并用封口膜密封；

c. 水浴摇床，140rpm，55℃过夜消化；

d. 待裂解完全后，取出EP管，静置室温，加入等体积Tris-饱和酚，上下颠倒10min；

e. 12000rpm离心10min，小心吸取上层水相，置入新的EP管；

f. 加等体积酚：氯仿：异戊醇混合液，酚、氯仿、异戊醇三种成分体积比为25: 24:1，颠倒混匀10 min；

g. 12000 rpm离心10 min，小心吸取上层水相，置入新的EP管；

h. 加等体积氯仿：异戊醇混合液，氯仿、异戊醇体积比为24: 1，颠倒混匀10 min；

i. 10000 rpm离心10min，小心吸取上层水相，置入新的EP管；

j. 加2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，水平摇大约30次，即可看到絮状DNA沉淀；

k. 10000 rpm离心10 min，去上清，留DNA沉淀；

l. 加1ml 70%冷乙醇，漂洗10 s，8000 rpm离心5 min，倒掉乙醇，自然干燥；

m. 加100 μl TE溶液，置于55℃水浴3~4 h，溶解DNA；

n. 将提取的DNA 保存于4℃冰箱。

（4）DNA纯度检测及定量

取1μl基因组DNA用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，Gel-red染色，紫外光下检测DNA质量。本实验所提取的部分DNA琼脂糖电泳检测结果见图1。由图1可见，DNA片段完整，点样孔无大量蛋白存在，DNA无明显降解，说明DNA量较高，可以满足进一步分析的需要。

取1μl样本按1:100比例稀释，用紫外分光光度计分别测定DNA样品在260nm和280nm条件下的吸光度，计算DNA的浓度和纯度。DNA浓度测定后，取出一定量溶液以TE缓冲液定量稀释至50 ng/μl，存于-80℃冰箱备用。

2．以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应；

鉴定东北林蛙遗传性别的PCR方法中，上游引物序列为SEQ ID NO :1所示的5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’，下游引物序列为SEQ ID NO :2所示的5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’。

扩增反应体系为10μl，包括：1 μl 10×Buffer，其中含pH 8.4浓度为200 mM的Tris-HCL和浓度为500 mM 的KCl； 0.2μl 浓度为2.5mM的dNTP；0.1μl 浓度为5 U/μ的Taq聚合酶；7.1μl灭菌去离子水；0.4μl浓度为10 pm/pl的上游引物；0.4μl浓度为10 pm/pl的下游引物；0.8μl浓度为50 ng/μl的DNA模板。

扩增反应条件为94℃ 4 min，1个循环；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1 min， 5个循环；94℃ 1 min， 51℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min, 1个循环，4℃保存。

3. PCR扩增产物的14%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳制备

配制14%的聚丙烯酰胺凝胶，100 ml 14%聚丙烯酰胺凝胶由46.7ml 30%丙烯酰胺,20.0ml 5×TBE，32.6 ml去离子水，0.7 ml 10%过硫酸铵和35 μl TEMED配制而成。配好凝胶溶液后可按下述办法和步骤灌胶。

a. 用热的0.8%的琼脂粉溶液将玻璃板边缘封住，将夹住封好的玻璃板与桌面30°斜放，倒胶口在上，将14%的聚丙烯酰胺凝胶溶液迅速摇匀后缓慢加入两块玻璃板中，直至灌满，注意不要产生气泡。

b.灌好胶后立即插入梳子。梳子要插的平直，顶端略高于玻璃板上端，便于胶凝好后拔出，注意梳子底端不要留有气泡。

c.室温聚合约45~60min，梳子底端的凝胶会出现折色率不同的线，表明凝胶聚合完成。

d. 拔起梳子时两手用力要均匀，保证加样孔平直。

e. 拔出梳子后立即用清水冲洗加样孔，以冲走多余的未聚合的丙烯酰胺。

f. 将带有凝胶的玻璃板转至电泳槽上，用铁夹固定。

g. 在上下两槽中倒入1× TBE缓冲液，注意观察上槽是否漏液。

（2）电泳

a. 预电泳10min，同时准备点样。

b. 取1μl PCR产物和含1μl含0.025%溴酚兰、0.025%二甲苯青、0.25%蔗糖溶液的上样缓冲液进行混匀，点样。

c. 设置电压为120V，电泳10~14h。

（3）染色

a. 电泳结束后取下玻璃板，用手术刀柄等物轻撬玻璃板边缘，用垫片将加样孔切齐，在开始加样的一侧切去一角作为标志，去离子水洗2~3次，每次2~3min；

b. 0.1%硝酸银银染15min；

c. 回收银染液后，用去离子水洗胶2~3次，每次2~3min；

d. 转入含1.5%氢氧化钠和1%甲醛的显色液中，边摇边观察，直至条带清晰。

e. 扫描并记录图像，筛选性别特异性条带。

（4）遗传性别鉴定

由图2可知，具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带，即图中方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。

4. PCR产物的纯化回收、测序

（1）目的片段的纯化回收

将具有性别特异性条带的PCR产物重新进行14%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳电压为120V，电泳10~14h。

电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶浸泡于1×ExRed核酸染料中，摇床染色20min。

紫外灯下切出含有目的DNA的聚丙烯酰胺凝胶，用纸巾吸干凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率，切胶时注意不要将DNA长时问暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。然后按照OMEGA Gel Extraction Kit的说明书上的操作步骤进行PCR产物的纯化回收操作。

具体如下：

a、将胶条放入干净的1.5ml的微量离心管中进行称重，以确定胶条的体积。假设胶的密度是1g/ml，其体积可以按如下得出：胶条的质量是0.3g，则其体积是0.3ml。加入等体积的结合缓冲液/Binding Buffer，即XP2。将混合物在50℃~55℃孵育7分钟或直至凝胶完全溶化，期间需每隔2~3分钟摇动或涡旋离心管。

胶完全溶解后，观测混合液的pH，如果pH值超过8.0，DNA的回收率将会大打折扣。具体操作为：若混合液的颜色变为橙色或红色，pH变大，加入5μl pH 为5.2，浓度为5M的醋酸钠，降低其pH值。调整后混合液的颜色应该变为浅黄色。

b. 将离心柱/ DNA Mini Column装在标配的2ml收集管/Collection Tube内。

c. 将700μl混合液加入到离心柱内，室温10000 x g离心1min。

d. 弃去离心液，将离心柱装在刚才用过的收集管内。如果溶液体积大于700 μl，则以每次700 μl的量依次装配离心柱、离心。每个离心柱的DNA总产量是25μg。如果期望产量大于25μg的上限，将样品分装入合适数量的离心柱内。

e. 加入300μl结合缓冲液/ Binding Buffer到离心柱内，室温10000 x g离心1min以冲洗离心柱。弃去离心液，重复利用收集管。

f. 加入700μl 已用无水乙醇稀释的SPW清洗液/ SPW Wash Buffer冲洗离心柱。室温10000 x g离心1min。

注意：SPW清洗浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释，按每25ml清洗浓缩液加入100ml无水乙醇的比例稀释。如SPW清洗液经过冷藏，使用前必须恢复至室温。

g. 可选建议使用，用另外的700μl SPW冲洗液重复第8步操作。

此后的任何操作流程如对盐敏感，执行二次清洗操作。

h. 弃去离心液，将空离心柱全速≥13000 x g离心2min，甩干离心柱的基质。去除离心柱内的乙醇非常关键，切不可遗漏此步骤。

i. 将离心柱置于一个干净的1.5ml微量离心管内。将15~30μl洗脱液/ ElutionBuffer直接加入到离心柱基质上，室温孵育1min。13000 x g离心1min洗脱DNA。这样可获得大约70%的DNA。可选择进行二次洗脱，以获得残留的DNA浓度较低。

离心柱内洗脱DNA的效率取决于洗脱液的pH值，如果使用去离子水洗脱DNA，请确保pH值在8.0左右。

j. DNA的回收产量和品质：测定样品在260mn和280nm的吸光度。

（2）PCR产物的连接

克隆反应体系： PCR Product，0.5~4μl； pEASY®-T1 Simple Cloning Vector ，1μl。

轻轻混匀，室温30℃反应10分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。

（3）连接产物的转化

a. 加连接产物于50μl Trans1-T1感受态细胞中，在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物轻弹混匀，冰浴20~30分钟。

b. 42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟。

c. 加250 μl平衡至室温的LB液体培养基，200 rpm、37°C培养1小时。

d. 取200 μl菌液均匀地涂在含60μg/mL氨苄青霉素Ampicillin的 LB平板上，在37 °C培养箱中过夜培养。为得到较多克隆，可将上一步菌液1500xg离心1分钟，弃掉部分上清，保留100~150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板。

e. 挑选白色克隆接种于1 ml LB/Amp液体培养基中，200 rpm、37℃培养6小时左右。

（4） PCR克隆产物的序列测定和拼接比对

取100 μl单克隆菌液，加入1.5ml EP管中，封口膜密封，寄吉林省库美生物科技有限公司测序。利用DNAMAN Version 5.2.2软件对所测序列进行序列分析，获得序列SEQ IDNO :3，GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGACCGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGTTTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC

ggctattcgt cgctactaaa ggtggggtca ctggcactta atgctgcccagttctgggtc 60

tctaaagaag gaccgtttaa catgagagtc tatggggaaa cagggtcatc tttaggcatg 120

tgcagaagtg aaaaatttgt tttgtttcgt ttcgtttcaa ttcgtcattt aatacatttc 180

gttaagttag gttcgttaca tgtgtcaaat tcgtacgcagtc 222。

Claims

1.一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是按以下步骤操作：（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGCTATTCGTCGCTACTAAAGG-3’ ，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’；（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应的222bp条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙；（4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQ ID NO :3，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列， GGCTATTCGTCGCTACTAAAGGTGGGGTCACTGGCACTTAATGCTGCCCAGTTCTGGGTCTCTAAAGAAGGAC CGTTTAACATGAGAGTCTATGGGGAAACAGGGTCATCTTTAGGCATGTGCAGAAGTGAAAAATTTGTTTTGTTTCGT TTCGTTTCAATTCGTCATTTAATACATTTCGTTAAGTTAGGTTCGTTACATGTGTCAAATTCGTACGCAGTC ，具有如SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的个体，表现为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQID NO 3所示核苷酸序列的个体为遗传雌性东北林蛙。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，分析PCR扩增产物时，电泳电压为120V，电泳时间为10 ~ 14h。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，扩增时，反应体系为10μl，包括：1 μl 10×Buffer，其中含pH 8 .4浓度为200 mM的 Tris-HCL和浓度为500 mM 的KCl； 0 .2μl 浓度为2 .5mM的dNTP；0 .1μl 浓度为5 U/μ的Taq 聚合酶；7 .1μl灭菌去离子水；0 .4μl浓度为10 pm/pl的上游引物；0 .4μl浓度为10 pm/pl的下游引物；0 .8μl浓度为50 ng/μl的DNA模板。

4.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，扩增时，反应条件为：94℃ 4 min，1个循环；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min， 5个循环；94℃ 1 min， 51℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min , 1个循环，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，应用权利要求1的步骤方法，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列确定待测东北林蛙的遗传性别，获得伪雄个体，作为父本与正常雌性抱对排卵，获得高雌性比例的子代。