CN115851977B - 鉴别珍珠鳖性别的分子标记、引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学方法鉴定动物性别的技术领域，具体涉及一种鉴别珍珠鳖性别的分子标记、引物对及其应用。基因组DNA包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的珍珠鳖，鉴别为雌性；基因组DNA包含如SEQ ID NO：3所示序列的珍珠鳖，鉴别为雄性。基于本发明中提供的鉴别珍珠鳖性别的分子标记鉴别珍珠鳖性别的方法，该方法不受年龄和样本限制，成本低、操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观准确，避免了采用传统方法耗时长、成本高和易出错等缺点，可以快速且准确的对各个时期的珍珠鳖进行性别鉴定，可缩短育种时间、大幅提高产量和降低饲养成本。

Description

鉴别珍珠鳖性别的分子标记、引物对及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学方法鉴定动物性别的技术领域，具体涉及一种鉴别珍珠鳖性别的分子标记、引物对及其应用。

背景技术

龟鳖类是较古老且形态最为特化的一支爬行动物，在地球上出现的最早记录是晚三叠纪，距今已有约2.2亿年的历史，被称为“活化石”。珍珠鳖(Apaloneferox)又名佛罗里达软壳龟，隶属于爬行纲(Reptilia)，龟鳖目(Chelonia)，鳖科(Trionychidae)，软鳖属(Palea)。原产于美国东南部，因其个体较大、裙边宽厚、营养丰富、味道鲜美，近年来引进我国。在生长方面，珍珠鳖雌性生长快、性成熟个体大，雄性则相反，存在很显著的性别差异。

珍珠鳖外形与中华鳖相似，生长也存在显著的性别差异，雌性生长快、性成熟个体大，雄性则相反，存在很显著的性别差异，即珍珠鳖养殖业具有高效全雌繁育的需求。目前，在珍珠鳖养殖过程中存在一个普遍的现象：养殖周期内，经过1-3次筛选分塘，“去雄留雌”，最终实现单养雌鳖的养殖模式。然而，鳖的养殖周期长、性成熟晚，雌雄要到1冬龄以上才能够通过外形鉴别，且鉴别效率低。如果能在鳖出壳后就对其遗传性别进行鉴定，可以在鳖苗早期就实现单性分塘养殖，养殖成本可以相应降低，其产量和效益也会显著提高。

一般来说，脊椎动物性别决定机制大致可以分为遗传性别决定(geneticsexdeterminati-on,GSD)和环境性别决定(environmentalsexdetermination,ESD)。不同于哺乳动物、鸟类等高等脊椎动物的体性别决定依赖于遗传物质，龟鳖类处于动物性别决定方式由环境决定型到基因决定型的过渡环节，为鳖类动物性别决定机制的阐明带来了困难。随着生物技术的发展，对中华鳖性别决定方式的认定由开始的温度依赖型(TSD)机制逐渐发展为基因决定型(GSD)机制的(ZZ/ZW型)。有学者揭示出鳖类动物的W性染色体的18SrRNA拷贝数比Z大很多，并设计了利用qPCR检验18SrRNA扩增的重复拷贝数的方法来鉴别雌雄，成功率为90％，但该方法成本昂贵，操作繁琐，且有10％的错误率。

因此，一种操作简单、成本低廉、鉴别效率、准确率高且能在性成熟前鉴别珍珠鳖性别的方法是有必要的。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种鉴别珍珠鳖性别的分子标记，通过鉴定该分子标记的在珍珠鳖全基因组DNA中的情况，就可以在珍珠鳖性成熟前准确地进行性别鉴定。

为了达到上述的目的，可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的分子标记，其包括如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列，基因组DNA包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的珍珠鳖，鉴别为雌性；基因组DNA包含如SEQ ID NO：3所示序列的珍珠鳖，鉴别为雄性。

本发明另一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的引物对，其为特异性扩增包括如SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列的引物对。

本发明再一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的检测试剂，其包括权利上述的鉴别珍珠鳖性别的引物对。

本发明再一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的试剂盒，其包括上述的检测试剂。

本发明再一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的方法，其包括：提取珍珠鳖基因组DNA作为DNA模板，使用上述的鉴别珍珠鳖性别的引物对进行PCR扩增得扩增产物，电泳扩增产物；扩增产物同时有1068bp和646bp条带，则为雌性珍珠鳖；扩增产物没有1068bp条带，有646bp条带，则为雄性珍珠鳖。

本发明有益效果至少包括：

(1)基于本发明中提供的鉴别珍珠鳖性别的分子标记鉴别珍珠鳖性别的方法，该方法不受年龄和样本限制，成本低、操作简便、可进行大批量鉴定，鉴别快速、结果直观准确，避免了采用传统方法耗时长、成本高和易出错等缺点，可以快速且准确的对各个时期的珍珠鳖进行性别鉴定，可缩短育种时间、大幅提高产量和降低饲养成本；

(2)本发明中提供的鉴别珍珠鳖性别的引物对本发明中的鉴别珍珠鳖性别的分子标记特异性强，准确率高，可在珍珠鳖早期鉴定出其遗传性别。

附图说明

图1为雌雄珍珠鳖DNA电泳示例图，其中♂为雄性珍珠鳖，♀为雌性珍珠鳖；

图2为特异引物在雌雄珍珠鳖群体中的验证电泳图，其中，Male:雄性，Female:雌性，M：2000bpmarker。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明实施例提供一种鉴别珍珠鳖性别的分子标记，其包括如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列，基因组DNA包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列的珍珠鳖，鉴别为雌性；基因组DNA包含如SEQ ID NO：3所示序列的珍珠鳖，鉴别为雄性。需要说明的是，可以通过现有测序技术对珍珠鳖基因组DNA进行测序或者进行表征来鉴别珍珠鳖的性别，可以快速的对于性成熟前的珍珠鳖进行鉴别，准确且高效。

本发明另一实施例提供一种鉴别珍珠鳖性别的引物对，其为特异性扩增包括如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列的引物对。需要说明的是，为了鉴定珍珠鳖基因组DNA中是否包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示序列，可以根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列设计引物，对珍珠鳖基因组DNA进行PCR扩增，然后根据PCR扩增产物情况来鉴别珍珠鳖性别，不需要进行测序，降低了鉴别成本；比如，可以根据PCR扩增产物的凝胶电泳条带的情况鉴别珍珠鳖性别。一些具体实施例中，包括如SEQ ID NO：1所示的珍珠鳖基因组DNA扩增产物对应的条带为1068bp条带，包括如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的珍珠鳖基因组DNA扩增产物对应的条带为646bp条带。即同时具有1068bp条带和646bp条带的为雌性珍珠鳖，只有646bp条带的为雄性珍珠鳖。

在一些具体实施例中，上述鉴别珍珠鳖性别的引物对，包括如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示的序列。具体地，鉴别珍珠鳖性别的引物对可以根据上述的鉴别珍珠鳖性别的分子标记进行设计，设计的引物需要对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列均具有特异性。本发明设计的如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的序列引物对可以特异性扩增如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列，特异性强，鉴别准确率高。

本发明再一实施例提供一种鉴别珍珠鳖性别的检测试剂，其可以包括权利上述的鉴别珍珠鳖性别的引物对。需要说明的是，上述鉴别珍珠鳖性别的引物对可以与常规辅助试剂组合成用于鉴别珍珠鳖性别的检测试剂；常规辅助试剂为本领域所已知的，比如PCR扩增反应体系中的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶或dNTP等。以上，包括上述鉴别珍珠鳖性别的引物对的检测试剂可以使得上述的鉴别珍珠鳖性别的分子标记与引物对对发生特异性扩增，从而鉴别珍珠鳖性别。

本发明再一方面提供一种鉴别珍珠鳖性别的试剂盒，其包括上述的检测试剂。需要说明的是，检测试剂盒的组成为本领域所已知的常规形式，比如检测试剂盒会设置试剂盒说明书，比如会有盛装各种检测试剂的试剂瓶，比如会设置成若干小格子用来放置检测试剂瓶，比如会有滴管用来移取检测试剂等。同样地，基于该检测试剂盒中的上述鉴别珍珠鳖性别的引物对对上述的鉴别珍珠鳖性别的分子标记有比较强的特异性。

本发明再一实施例提供一种鉴别珍珠鳖性别的方法，其可以包括：提取珍珠鳖基因组DNA作为DNA模板，使用上述的鉴别珍珠鳖性别的引物对进行PCR扩增得扩增产物，电泳扩增产物；扩增产物同时有1068bp和646bp条带，则为雌性珍珠鳖；扩增产物没有1068bp条带，有646bp条带，则为雄性珍珠鳖。需要说明的是，通过对珍珠鳖基因组DNA使用上述的鉴别珍珠鳖性别的引物对进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行凝胶电泳，通过电泳条带鉴别珍珠鳖性别，成本比较低廉、结果直观且准确率很高。

在一些具体实施例中，上述鉴别珍珠鳖性别的方法中，PCR扩增程序可以包括：94℃，30s；98℃，10s；58℃，30s；72℃，60s；35循环，72℃，2min。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，实验所用珍珠鳖均来自广东省广州市花地湾花鸟鱼虫市场，随机选取珍珠鳖共60只(30只雄性珍珠鳖和30只雌性珍珠鳖)，经性腺解剖学和组织学检测性别后，剪取各个个体的肌肉组织，无水乙醇浸泡保存于-20℃，待用。

以下实施例中，特异性扩增(PCR扩增)按照以下步骤进行：(1)使用DNA提取试剂盒，提取雌雄珍珠鳖的全基因组DNA，利用凝胶电泳检测DNA质量，DNA检测合格后，存放在-20℃备用；(2)使用引物F：SEQ ID NO：3；R：SEQ ID NO：4(根据已获得的雌雄珍珠鳖深度全基因组测序对比分析构建的性别特异性分子数据库，在性别特异的DNA序列片段上设计并验证获得的性别标记引物)，对提取的雌雄珍珠鳖DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体积为20uL，包括：PCRMix 10μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50μg/ml-100μg/ml模板DNA1μL，超纯水7μL；PCR反应程序为：94℃，30s；98℃，10s；58℃，30s；72℃，60s；35循环，72℃，2min；(3)反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

以下实施例中，特异引物扩增片段测序按照以下步骤进行：将PCR扩增产物用E.Z.N.A.TMGelExtractionKit(OmegaBio-Tek,Guangzhou,China)纯化回收，将回收的DNA连接到的PMDTM19-T(TaKaRaBiotechnology,Guangzhou,China)载体，挑选阳性克隆检测，进行测序。

实施例1特异引物对在群体中的验证

(1)选取雌雄珍珠鳖各30个样本分别按照上述特异性扩增(PCR扩增)的方法进行全基因组DNA，并使用凝胶电泳检测DNA提取质量，结果如图1所示，结果显示DNA提取质量良好；

(2)按照上述特异性扩增(PCR扩增)的方法以步骤(1)提取的全基因组DNA作为DNA模板分别进行PCR扩增得扩增产物，然后进行凝胶电泳，结果如图2所示，30只样本中，雌性珍珠鳖DNA扩增产物在646bp和1068bp处均有PCR特异性条带，雄性珍珠鳖DNA扩增产物在646bp处均有PCR特异性条带，表明该引物能准确鉴别珍珠鳖性别；

(3)对步骤(2)扩增产物进行测序，结合测序结果和1068bp和646bp条带得知，雌性珍珠鳖长条带测序序列如如SEQ ID NO：1所示，雌性珍珠鳖短条带测序序列如SEQ ID NO：2所示；雄性珍珠鳖条带测序序列如SEQ ID NO：3所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (5)

1. 引物对在鉴别珍珠鳖性别中的应用，其特征在于，引物对序列如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示。

2.引物对在制备鉴别珍珠鳖性别的检测试剂中的应用，其特征在于，引物对序列如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

3.引物对在制备鉴别珍珠鳖性别的试剂盒中的应用，其特征在于，引物对序列如SEQID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

4.一种鉴别珍珠鳖性别的方法，其特征在于，包括：提取珍珠鳖基因组DNA作为DNA模板，使用引物对进行PCR扩增得扩增产物，电泳扩增产物；扩增产物同时有1068bp和646bp条带，则为雌性珍珠鳖；扩增产物没有1068bp条带，有646bp条带，则为雄性珍珠鳖；引物对序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

5.根据权利要求4所述的鉴别珍珠鳖性别的方法，其特征在于，PCR扩增程序包括：94℃，30s；98℃，10s；58℃，30s；72℃，60s；35循环，72℃，2min。