CN113862379B

CN113862379B - 一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法

Info

Publication number: CN113862379B
Application number: CN202111232187.4A
Authority: CN
Inventors: 叶欢; 阮瑞; 李创举; 岳华梅; 宋信华
Original assignee: Hubei Governor's Kiss Breeding Farm; Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Hubei Governor's Kiss Breeding Farm; Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2041-10-22
Also published as: CN113862379A

Abstract

本发明公开了一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法。所述长吻鮠雄性特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。利用扩增引物对长吻鮠基因组DNA进行PCR扩增，产物进行电泳检测，若扩增出特异性条带，则长吻鮠鉴定为雄性个体，若未扩增出特异性目的条带，则为雌性个体，该遗传性别鉴定方法简单、快速、直接，且准确率高，对鱼体伤害小，不受长吻鮠发育时期的限制，解决了长吻鮠发育早期性别鉴定困难的难题，为生产上实现长吻鮠的性别控制育种具有重要意义。

Description

一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法

技术领域

本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法。

背景技术

长吻鮠（Leiocassis longirostris Gunther）属于、鲶形目、鲿科、鮠属，俗称江团、肥沱，因其吻部较一般鱼长，故而学名是长吻鮠。长吻鮠主要分布于长江干支流和大型通江湖泊中，是一种名贵的淡水经济鱼类，其肉质细嫩、鲜美，无肌间刺且含肉率较高，鳔肥厚，素有“不吃江团，不知鱼味”的美称。由于环境恶化、资源锐减及人工捕捞等多方面因素影响，我国野生长吻鮠资源急剧衰竭，数量急剧减少。

长吻鮠雌雄个体生长存在显著差异，通常雄性个体的生长速度快于雌性，因此，培育长吻鮠雄性养殖群体具有商业化的生产价值。然而，长吻鮠的初次性成熟时间较长，需要3-5年，且在发育早期无法从形态外观上判断雌雄。传统的长吻鮠性别判断方法是通过观察生殖突，结合挤压腹部，观察是否有卵子或精子流出生殖孔，甚至很多时候需要通过解剖才能判定长吻鮠是否为雄性。特别是在长吻鮠的雄性腺发育早期，需要解剖观察性腺，甚至要利用组织切片手段，不仅造成了资源的浪费，还影响了长吻鮠的人工繁育和全雄品种的培育。因此，目前急需开发简单、便捷、准确的方法来鉴定长吻鮠的性别，进而加快全雄长吻鮠苗种培育的进程。

DNA分子标记已成为鉴定鱼类性别的重要工具，随着高通量测序技术的快速发展，测序技术已成为一种高效开发分子标记的方法。但目前关于长吻鮠性别鉴定相关的分子标记还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法。所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记解决了长吻鮠早期性别鉴定的难题，对开展长吻鮠性控育种具有重要意义，从而促进长吻鮠养殖产业的发展。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记，所述长吻鮠雄性性别特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记的扩增引物，所述扩增引物的序列为：

F：TAGGTTGATGACCCGCGACTGTCT；

R：TGTGGGAATGTTTTAAGAATCCTTAC。

本发明还提供了利用所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记的遗传性别鉴定方法，所述遗传性别鉴定方法包括以下步骤：

（1）提取待测的长吻鮠的基因组DNA；

（2）用所述长吻鮠雄性性别特异性分子标记的扩增引物对长吻鮠的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；

（3）对PCR产物进行电泳检测，若扩增出特异性目的条带，待测长吻鮠为雄性个体，若未扩增出特异性目的条带，待测长吻鮠为雌性个体。

进一步的，所述特异性目的条带的大小为501 bp。

进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：基因组DNA 50 ng；2×EasyTaq® PCRSuperMix 10 μl；上下游引物各0.4 μl；补充ddH₂O至20 μl。

进一步的，所述基因组DNA的浓度为50 ng/μl ~200 ng/μl；所述上下游引物的浓度为10 μM~20μM。

进一步的，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，34个循环；72℃最后延伸10 min。

进一步的，所述基因组DNA采集自长吻鮠的鳍条、血液或组织。

本发明还提供了所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记在用于筛选长吻鮠雄性个体中的应用。

本发明还提供了所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记的扩增引物在制备筛选长吻鮠雄性个体的试剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过高通量测序和比较基因组的方法，获得了一种全新的长吻鮠雄性性别特异性分子标记，并根据该分子标记的序列得到了用于检测分子标记的引物，该分子标记可以不受长吻鮠发育时期的影响，快速简单的鉴定出长吻鮠的雄性性别，且对长吻鮠伤害小。本发明还利用常规PCR扩增对长吻鮠性别开展鉴定，所述分子标记的鉴定准确率达100%。与之前解剖检测或观察生殖突相比，该技术具有准确、快速的优点，解决了长吻鮠发育早期性别鉴定困难的难题，为在生产上实现长吻鮠的性控育种具有重要的意义。

附图说明

图1为长吻鮠雄性性别特异性DNA片段在遗传性别鉴定的结果电泳图；其中，泳道1-12为雌性个体，泳道13-24为雄性个体，N为阴性对照，M为DL2000 DNA marker。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：长吻鮠雄性特异性分子标记的获得

用Bouin's固定液固定长吻鮠性腺组织，通过石蜡切片和HE染色鉴定长吻鮠的性别。提取雌雄各16尾长吻鮠血液基因组DNA，构建测序文库，Illumina测序仪测序，获得长吻鮠雌雄个体全基因组测序数据，通过比较基因组学方法分析得到雄性性别特异性DNA片段，根据此序列设计相应的引物，并通过群体验证，证明其有效性，最终获得了核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的长吻鮠雄性性别特异性分子标记。

实施例2：长吻鮠性别鉴定的特异性分子标记的应用

1、针对实施例1中核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的分子标记设计引物：

F：TAGGTTGATGACCCGCGACTGTCT（SEQ ID No.2）；

R：TGTGGGAATGTTTTAAGAATCCTTAC（SEQ ID No.3）。

2、PCR扩增：

提取长吻鮠的基因组DNA作为模板，利用引物进行PCR扩增；

反应体系为：模板DNA约50 ng；2×EasyTaq® PCR SuperMix 10 μl；浓度为10 μM的上下游引物各加入0.4 μl；补充ddH₂O至20 μl。

所用PCR反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，34个循环；72℃最后延伸10 min。

3、电泳检测：

配制1.5％的琼脂糖凝胶，PCR扩增完成后，取4.0 μl PCR产物进行电泳检测；扩增出特异性条带为雄性个体，扩增不出特异性条带为雌性个体。

实施例3：长吻鮠雄性性别特异性分子标记在长吻鮠性别鉴定中的应用验证

1、采集已知性别的长吻鮠雌雄个体各12尾，将鳍条样本置于无水乙醇中保存，利用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，测量浓度后稀释至50 ng/μl，保存于-20℃备用。

2、以步骤1的长吻鮠基因组DNA为模板，利用实施例2的引物进行PCR扩增，反应体系和PCR反应程序均与实施例2相同，得到的PCR产物进行电泳检测。

3、扩增结果参见图1，其中M为DL2000 DNA marker，N为阴性对照，左侧泳道1-12为雌性个体，均未扩增出特异性目的条带，右侧泳道13-24为雄性个体，均能扩增出大小为501bp的特异性目的条带。由此说明，本发明得到的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的长吻鮠雄性特异性分子标记及其引物，能够准确、简单、快速的对长吻鮠进行性别鉴定，有利于全雄长吻鮠苗种的筛选和培育。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

湖北省长吻鮠良种场

<120> 一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记及其扩增引物和遗传性别鉴定方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtgtgtgt gagtatgtga gtgtggctta tctttaggtt gatgacccgc gactgtctat 60

atccttataa aaggtcttcg cgtgccggct tttcagaaac ttcaaaaata ggatggagac 120

cgtgctagat acgttttcag gctctgactt ttccccttct tcctcttctt cctcgtcgta 180

cgatgtgtct tgtttttcag ataacggtgt gctgcggctg aagaggctca gaagagcgcg 240

gtcagaacag gagatgcagc agccgcgcga cgcttccaac gtgcgcgaac gcagacgcgt 300

gcagtccatc aaagacgggt ttgaaggtct gcgctcgcac atccccaccc tgccttatga 360

gaaacgtctt tccaaagtag acacgctacg cctcgccatc ggctacatca acttcttagc 420

tgaactcgtg cagtccgagg ctcccattcg gaactccagt tacgaagctc taacccagcc 480

caaaaaagtc atctactaca gagagacaag taaggattct taaaacattc ccacacttaa 540

catgcgttag tat 553

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taggttgatg acccgcgact gtct 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgggaatg ttttaagaat ccttac 26

Claims

1.一种长吻鮠雄性性别特异性分子标记，其特征在于，所述长吻鮠雄性性别特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；具有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的个体为雄性长吻鮠个体，缺失核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的个体为雌性长吻鮠个体。

2.检测权利要求1所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记的试剂在用于筛选长吻鮠雄性个体中的应用，其特征在于，所述试剂为PCR试剂；以待测长吻鮠基因组DNA为模板，采用所述试剂进行PCR扩增，若能够扩增出所述长吻鮠雄性性别特异性分子标记，则待测长吻鮠的性别为雄性，若未扩增出所述长吻鮠雄性性别特异性分子标记，则待测长吻鮠的性别为雌性。

3.权利要求1所述的长吻鮠雄性性别特异性分子标记的扩增引物在用于制备筛选长吻鮠雄性个体的试剂中的应用，其特征在于，所述扩增引物的序列为：

F：TAGGTTGATGACCCGCGACTGTCT；

R：TGTGGGAATGTTTTAAGAATCCTTAC；

以待测长吻鮠基因组DNA为模板，采用所述扩增引物进行PCR扩增，若能够在501 bp处扩增出特异性目的条带，则待测长吻鮠为雄性个体；若未能够在501 bp处扩增出特异性目的条带，则待测长吻鮠为雌性个体。