CN105695590A - 用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组，包括用于扩增COI基因的引物对，由引物COIF和引物COIR组成；以及用于扩增ITS序列的引物对，由引物ITSF和引物ITSR组成。本发明还提供了一种用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的包含以上引物组的试剂盒，所述试剂盒还可包含以下试剂中的一种或多种：PCR用的缓冲液、dNTP、耐热的DNA聚合酶、克隆载体、DNA连接酶、连接反应用的缓冲液。本发明还提供了一种鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法。使用本发明的引物组、试剂盒或方法，可精确地鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本，从而有效地管理育种计划，监测其负面影响，和水产养殖业的可持续发展具有重要的作用。

Description

用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的引物组、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，更特别地涉及用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

杂交育种是一种重要的鱼类育种方法，其是利用具有优良性状的品种、品系或个体进行杂交，产生新的优良性状，使后代获得遗传改良，出现可利用的杂种优势。在我国先后通过杂交育种技术成功培育出了丰鲤、荷元鲤、岳鲤、芙蓉鲤、奥尼罗非鱼、杂交鳢、赣昌鲤鲫、杂交鲌“先锋1号”、杂交翘嘴鲂等一大批水产杂交新品种，在水产养殖中起到了重要的作用。

鲿科鱼类在我国广布于长江、珠江、黑龙江和黄河流域，包括4个属30多个种。由于其肌间刺少、肉质细嫩、营养丰富等特点，已经成为我国重要的水产养殖对象。近年来，越来越多的鲿科鱼类正被开发和利用，黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、乌苏拟鲿、长吻鮠等众多鱼类被用以养殖生产实践中，同时也有利用它们生产杂种后代进行研究和养殖的。然而，截止目前鲿科鱼类的分类仍旧存在一定的问题，分类地位混淆。杂交生产的杂种后代由于从外部形态特征上难以区分，从而为种质资源的鉴定更加增加了难度。如果杂种个体从养殖场逃逸将带来潜在危害，可能会引起基因资源的污染和一些种群或种的消失。

精确鉴定杂种个体对于制定杂交育种方案，有效地管理育种计划，监测其负面影响，和水产养殖业的可持续发展具有重要的作用。黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)和长吻鮠(Leiocassislongirostris)的杂交工作已经开始，其后代表现出良好的生长优势，但是截至目前仍旧没有可以用于鉴定其后代的方法，因此发明一种可以用于其杂种个体鉴定的方法尤其必要。

发明内容

本发明基于COI基因和ITS序列在进化上的适度保守性为解决上述技术问题提供了如下技术方案：

用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组，包括以下引物：

用于扩增COI基因的引物对，由具有SEQIDNO.1所示序列的引物COIF以及具有SEQIDNO.2所示序列的引物COIR组成；

用于扩增ITS序列的引物对，由具有SEQIDNO.3所示序列的引物ITSF以及具有SEQIDNO.4所示序列的引物ITSR组成。

本发明还提供了用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的试剂盒，其包含上述引物组。

进一步地，所述试剂盒还可包含分子克隆中所用到的PCR试剂、克隆载体、连接反应所需的试剂等。

PCR试剂主要有PCR用的缓冲液、dNTP、耐热的DNA聚合酶。其中，所述耐热的DNA聚合酶可为TaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合物或其他用于在PCR反应中合成DNA的DNA聚合酶，或这些DNA聚合酶的组合。

所述克隆载体选自pMD18-T、pBR系列载体、PUC系列载体以及其他用于原核扩增的质粒载体，或其衍生载体。

连接反应所需的试剂包括DNA连接酶、连接反应用的缓冲液。其中，所述DNA连接酶可为T4DNA连接酶。

本发明还提供了一种用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA；

2)以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增COI基因的引物对PCR扩增COI基因；

3)将步骤2)得到的扩增产物克隆至克隆载体上，然后用于转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落测序；

4)利用遗传分析软件如MEGA将步骤3)测序得到的序列与SEQIDNO.5所示的标准黄颡鱼COI基因序列和SEQIDNO.6所示的标准长吻鮠COI基因序列构建进化树，通过聚类结果判定所述待测个体的母本，如果步骤3)所得到的序列与SEQIDNO.5聚类到一枝，则母本为黄颡鱼，如果与SEQIDNO.6聚类到一枝，则母本为长吻鮠；

5)分别以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增ITS序列的引物PCR对扩增ITS序列；

6)当步骤5)中扩增得到的三种DNA片段进行琼脂糖电泳，从所述待鉴定个体扩增到两个条带，结合步骤4)中的母本鉴定结果来鉴定父本。

本发明可精确鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本，从而有效地管理育种计划，监测其负面影响，和水产养殖业的可持续发展具有重要的作用。

附图说明

图1为根据本发明的方法对从6个待鉴定个体(S1-S6)扩增的COI基因与黄颡鱼(H1-H3)和长吻鮠(C1-C3)的标准COI序列构建的进化树聚类图；

图2为根据本发明的方法对从6个待鉴定个体(S1-S6)以及黄颡鱼(H1-H3)和长吻鮠(C1-C3)扩增的ITS序列跑琼脂糖凝胶电泳得到的电泳图，其中泳道1-3为H1-H3的扩增产物，泳道4-6为S1-S3的扩增产物，泳道7-9为C1-C3的扩增产物，泳道10-12为S4-S6的扩增产物，泳道M为Marker。

具体实施方式

在鱼类生物基因组中，遗传信息主要包含于染色体中，但是染色体外的一些细胞器中也存在遗传信息，线粒体就是这样的细胞器，有一些基因仅由线粒体中的DNA编码，而在染色体中没有相应的基因。由于线粒体只能通过母本传给子代，所以这种遗传方式也称为母系遗传。因此，可通过检测只在线粒体中存在的基因来判断杂交种的母本来自哪个物种。

细胞色素氧化酶(cytochromeoxidase)是线粒体电子传递链末端的酶，具有质子泵的作用，正是由于其关键的作用，导致其在进化中偏保守。细胞色素氧化酶I亚基(cytochromeoxidasesubunitI，COI)是细胞色素氧化酶的一个亚基，COI基因具有适中的进化速率，使其可作为种属系统进化研究的良好标记，以鉴别亲缘关系较近的物种。

转录中的核糖体RNA(rRNA)是细胞核核仁组织区中的重要组成部分，其在转录并加工完毕后即与核糖体结合，以维持核糖体的空间结构。rRNA分为5S、18S、5.8S和28SrRNA，18S、5.8S和28SrRNA是串联转录的，其相应的编码序列由18S、5.8S和28SrDNA以及之前的间隔序列构成。其中，5.8SrDNA与28SrDNA之间的间隔序列称为ITS序列，相对于保守的rDNA序列，ITS序列的长度和序列组成变化较大，因此，可通过对其进行分析来区分关系非常近的物种。

本发明正是基于上述两种序列在进化上的适度保守性来精确鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本。

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组

本发明用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组由两组引物对组成，这两组引物对分别为：

用于扩增COI基因的引物对，其中正向引物COIF为SEQIDNO.1所示的序列：5’-CTACAATCCACCGCCTAA-3’，反向引物COIR为SEQIDNO.2所示的序列：5’-TAGAAGAAAGTGACAGAGCG-3’；

用于扩增ITS序列的引物对，其中正向引物ITSF为SEQIDNO.3所示的序列：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’，反向引物ITSR为SEQIDNO.4所示的序列：5’-ATCCACCGCTAAGAGTTGTCAG-3’。

实施例2用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种父本和母本的试剂盒

发明用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的试剂盒包含以下成分：

1)用于扩增COI基因的引物对，其中正向引物COIF为SEQIDNO.1所示的序列：5’-CTACAATCCACCGCCTAA-3’，反向引物COIR为SEQIDNO.2所示的序列：5’-TAGAAGAAAGTGACAGAGCG-3’；

2)用于扩增ITS序列的引物对，其中正向引物ITSF为SEQIDNO.3所示的序列：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’，反向引物ITSR为SEQIDNO.4所示的序列：5’-ATCCACCGCTAAGAGTTGTCAG-3’；

3)PCR用的10×缓冲液；

4)dNTP；

5)TaqDNA聚合酶；

6)克隆载体pMD18-T；

7)Solution(包含T4DNA连接酶及其缓冲液)；

8)LATaqDNA聚合酶；

9)2×GC缓冲液。

以上试剂中，引物通过人工合成得到，其他试剂购自生化商店。

实施例3使用上述试剂盒鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种父本和母本

本发明的用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的方法包括以下步骤：

1、收集6个待鉴定个体S1-S6以及纯种黄颡鱼H1-H3和纯种长吻鮠C1-C3的尾鳍，并保存在无水乙醇中，带回实验室。

2、基因组DNA提取

使用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取DNA。

3、杂种的母本鉴定

3.1COI基因PCR扩增

以按上文所述提取的DNA为模板，使用引物对COIF/COIR，通过PCR扩增COI基因，PCR扩增体系如下：

PCR反应过程为：94℃预变性5min，35个循环(94℃变性30sec，退火52℃30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

3.2扩增产物的克隆与测序

(1)扩增产物克隆反应体系：

(2)实验步骤

16℃反应30min，全量加入至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中(Takara公司)，冰中放置30min；42℃加热45s后，再在冰中放置1min；加入800μl不含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，50rpm/min震荡45min；在含有氨苄青霉素的固体LB培养基平板上过夜培养；挑取单菌落，至含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，280rpm/min培养3h。

(3)测序

将挑选的单菌落送至测序公司测序(武汉天一辉远生物科技有限公司)

3.3进化树构建

利用序列比对软件如DNAstar软件处理测定的序列，然后用遗传分析软件MEGA将测序得到的序列与黄颡鱼COI基因标准序列和长吻鮠COI基因标准序列构建进化树。

黄颡鱼COI基因标准序列：

AAAGACATTGGTACCCTCTACTTAGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTTGGCACAGCCCTTAGCCTGCTAATTCGGGCTGAGCTAGCCCAACCCGGAGCCCTTCTAGGGGATGACCAGATTTATAACGTCATTGTTACTGCTCATGCCTTCATCATAATTTTCTTTATAGTAATGCCAATCATGATCGGAGGCTTTGGCAACTGACTTGTGCCACTAATAATTGGAGCACCAGATATGGCATTCCCACGAATAAACAACATGAGCTTCTGATTACTACCTCCCTCCTTCCTGCTGCTACTAGCCTCCTCCGGAGTTGAAGCCGGGGCAGGAACAGGATGAACTGTTTACCCCCCACTTGCTGGAAACCTTGCACACGCGGGGGCCTCTGTAGACTTAACTATCTTCTCTCTACATCTCGCAGGTGCATCCTCTATTCTAGGAGCAATTAATTTCATCACAACTATTATTAACATAAAACCCCCTGCCATCTCCCAATACCAAACTCCCTTATTTGTTTGAGCCGTCCTAATTACAGCAGTACTCCTACTACTATCCCTGCCCGTCTTAGCTGCCGGCATTACAATGCTATTAACAGACCGCAACCTTAACACAACCTTCTTCGATCCTGCCGGAGGAGGAGACCCCATCCTTTACCAACACTTATTCTGATTCTTTGGCCACCCAGAAGTGTACATTTTAATTCTTCCAGGGTTTGGAATAATCTCCCATATTGTAGCCTACTA-CTCTGGG-AAAAAAGAGCCCTTTGG-TTATATAGGAATA-GTATGAGCCATAATGGCCATCGGCTTATTAGGTTTCATCGTATGAGCCCATCATATGTTTACAGTAGGAATAGACGTAGACACTCGAGCATATTTTACATCCGCAACAATAATCATTGCAATTCCAACAGGCGTAAAAGTATTCAGCTGACTTGCTACCTTGCATGGAGGGTCAATCAAATGAGAAACCCCTATATTATGGGCCCTTGGTTTTATTTTCCTATTCACTGTAGGAGGCCTCACAGGAATCGTGTTAGCCAACTCATCCCTCGACATTGTACTTCATGACACATATTATGTAGTAGCCCACTTCCACTACGTCTTATCAATGGGGGCCGTATTTGCCATCATAGGAGCCTTCGTACACTGATTCCCCCTATTTACGGGCTATACAATACATGACACCTGAACAAAAATCCACTTTGGAACAATATTTGTAGGAGTTAATCTTACCTTCTTCCCCCAACACTTCCTAGGCTTAGCTGGCATGCCACGACGATATTCAGATTACCCAGACGCCTACTCATTATGAAACATTATTTCATCTGTTGGTTCCCTAATCTCTCTAGTAGCAGTCGTAATATTCCTCTATATCTTATGAGAAGCCTTCACTGCTAAACGAGAAGTGCTCTCTGTCGAATTAACCTCTACAAACGTAGAGTGATTGCACGGGTGCCCTCCACCTTACCACACATTTGAAGAACCAGCATTCGTACAAGTACGAACAAATTAA(SEQIDNO.5)

长吻鮠COI基因标准序列：

AAAGACATTGGTACCCTCTACTTAGTATTTGGTGCTTGAGCCGGAATAGTTGGTACAGCCCTTAGCCTGCTAATTCGGGCTGAGCTAGCCCAACCCGGGGCCCTTCTAGGGGATGACCAGATTTACAACGTTATTGTTACTGCTCATGCCTTCATCATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATCATAATCGGAGGCTTTGGTAACTGACTTGTGCCACTAATAATTGGAGCACCAGATATAGCATTCCCACGAATAAATAATATAAGTTTCTGACTACTTCCCCCATCTTTCCTACTGCTATTAGCTTCTTCCGGAGTTGAAGCCGGGGCAGGTACAGGATGAACTGTTTATCCCCCTCTTGCCGGAAATCTCGCACACGCCGGGGCTTCTGTAGACTTAACCATCTTTTCTCTCCACCTCGCAGGTGTATCCTCTATTCTAGGAGCCATTAATTTCATCACAACCATTATTAACATAAAACCCCCTGCTATCTCCCAATATCAAACCCCTCTATTCGTTTGAGCCGTTCTAATTACAGCTGTACTTCTACTATTATCCCTACCCGTTCTGGCTGCTGGCATTACAATACTCCTAACAGACCGTAACCTTAATACAACATTCTTTGACCCAGCCGGAGGAGGAGATCCTATCCTTTATCAACATTTATTTTGATTCTTTGGCCACCCAGAAGTATACATTTTAATTCTTCCAGGCTTTGGAATAATTTCTCACATCGTAGCCTACTA-CTCTGGGAAAAAA-GAACCCTTTGG-ATATATAGGAATA-GTTTGAGCTATAATAGCCATCGGATTATTAGGTTTTATCGTATGAGCCCATCACATATTTACAGTAGGAATGGACGTAGACACTCGAGCATACTTTACATCCGCAACAATAATTATCGCAATCCCAACAGGTGTAAAAGTATTCAGCTGACTTGCTACTCTGCATGGAGGATCCATCAAATGAGAAACCCCTTTATTATGGGCCCTTGGCTTTATCTTCCTATTTACTGTAGGAGGGCTCACAGGAATCGTATTAGCCAACTCATCCTTAGACATTGTACTTCATGACACATATTATGTAGTAGCCCACTTTCATTATGTCCTATCAATAGGAGCTGTATTTGCCATTATAGGAGCCTTTGTACACTGATTCCCTCTATTCACAGGTTACACAATACATGACACCTGAACAAAAATTCACTTCGGAACAATATTTGTAGGAGTTAACCTCACCTTCTTCCCCCAACATTTCCTAGGCTTGGCCGGAATGCCACGACGATATTCAGACTACCCAGACGCCTACTCACTATGAAACATTATTTCATCCATTGGCTCTATAGTCTCTCTAGTGGCAGTCGTAATATTTCTTTATATTTTATGAGAAGCCTTTACTGCCAAACGAGAAGTAATGTCCGTCGAATTAACCTCCACAAACGTAGAATGATTACACGGATGTCCTCCGCCTTACCATACATTTGAAGAACCAGCATTCGTACAAGTACGAACAAATTAA(SEQIDNO.6)

进化树聚类结果在图1中示出，其显示，待鉴定个体S1、S3、S5、S6以及C1-C3与长吻鮠COI基因标准序列聚为一类，S2、S4和H1-H3与黄颡鱼COI基因标准序列聚为一类。这表明，S1、S3、S5和S6的母本为长吻鮠，并且S2和S4的母本为黄颡鱼。

3、杂种的父本鉴定

3.1ITS序列PCR扩增

以按上文所述提取的DNA为模板，使用引物对ITSF/ITSR，通过PCR扩增ITS序列，PCR扩增体系如下：

PCR反应过程为：94℃预变性1min，30个循环(94℃变性30sec，退火60℃30sec，72℃延伸2min)，72℃延伸5min，4℃保存。

3.2扩增产物的检测

扩增产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图在图2中示出。结果显示，纯种黄颡鱼样品H1-H3的扩增产物为一条700bp左右的扩增带，纯种长吻鮠样品C1-C3的扩增产物为一条600bp左右的扩增带，待鉴定样品S1-S6的扩增产物为两条扩增带，其中一条700bp左右，另一条600bp左右。根据上文，S1、S3、S5和S6的母本为长吻鮠，所以，其两条带中600bp的扩增带来自母本染色体，而剩余的那条700bp的扩增带来自父本染色体，来自父本染色体的扩增带与纯种黄颡鱼的扩增带相对应，因此可确定其父本为黄颡鱼。同理可知，S2和S4的父本为长吻鮠。

通过上述方法确定，待鉴定个体S1、S3、S5和S6的母本为长吻鮠，父本为黄颡鱼；待鉴定个体S2和S4的母本为黄颡鱼，父本为长吻鮠。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的引物组，其特征在于，包括以下引物：

用于扩增COI基因的引物对，由具有SEQIDNO.1所示序列的引物COIF：5’-CTACAATCCACCGCCTAA-3’以及具有SEQIDNO.2所示序列的引物COIR：5’-TAGAAGAAAGTGACAGAGCG-3’组成；

用于扩增ITS序列的引物对，由具有SEQIDNO.3所示序列的引物ITSF：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’以及具有SEQIDNO.4所示序列的引物ITSR：5’-ATCCACCGCTAAGAGTTGTCAG-3’组成。

2.用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含以下试剂中的一种或多种：PCR用的缓冲液、dNTP、耐热的DNA聚合酶、克隆载体、DNA连接酶、连接反应用的缓冲液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述耐热的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合物或其他用于在PCR反应中合成DNA的DNA聚合酶，或这些DNA聚合酶的组合。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。

6.根据权利要求2-5所述的试剂盒，其特征在于，所述克隆载体选自pMD18-T、pBR系列载体、PUC系列载体以及其他用于原核扩增的质粒载体。

7.一种鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA；

2)以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增COI基因的引物对PCR扩增COI基因；

3)将步骤2)得到的扩增产物克隆至克隆载体上，然后用携带有所述扩增产物的克隆载体转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落测序；

4)利用遗传分析软件将步骤3)测序得到的序列与SEQIDNO.5所示的标准黄颡鱼COI基因序列和SEQIDNO.6所示的标准长吻鮠COI基因序列构建进化树，通过聚类结果判定所述待测个体的母本，如果步骤3)所得到的序列与SEQIDNO.5聚类到一枝，则母本为黄颡鱼，如果与SEQIDNO.6聚类到一枝，则母本为长吻鮠；

5)分别以步骤1)中得到待鉴定个体的DNA、黄颡鱼的DNA和长吻鮠的DNA为模板，使用权利要求1中所述的用于扩增ITS序列的引物PCR对扩增ITS序列；

6)将步骤5)中扩增得到的三种DNA片段进行琼脂糖电泳，如果从所述待鉴定个体扩增到600bp和700bp长的两条扩增带，则所当步骤4)确定所述待鉴定个体的母本为黄颡鱼时，所述待鉴定个体的父本为长吻鮠，当步骤4)确定所述待鉴定个体的母本为长吻鮠时，所述待鉴定个体的父本为黄颡鱼。

8.根据权利要求7所述的鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本的方法，其特征在于，步骤4)中用到的所述遗传分析软件为MEGA。