CN106868112A - 一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法 - Google Patents

一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代【翘嘴鲌（♀）×三角鲂（♂）】分子鉴定的方法，属于分子生物学技术领域。本研究通过选择翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的核糖体DNA的第一内转录间隔区（ITS1）基因，该基因在三种鱼中扩增片段大小存在显著的差异。设计一对通用引物，通过PCR扩增ITS1区域来区分翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。本发明所建立的方法具有特异性强、可信度高，可应用于翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的品种鉴定。

Description

一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代【翘嘴鲌(♀)×三角鲂(♂)】分子鉴定的方法，属于生物工程领域。
背景技术
翘嘴鲌、三角鲂是分别隶属于鲌亚科鲌属和鲂属的重要经济鱼类，前者为中上层鱼类，体型细长，肉食性，其自然个体大、肉质细嫩、经济价值高，但肌间刺多、人工养殖成本高，且性情急躁，不易捕捞及活鱼运输；而后者为中下层鱼类，体型宽厚，其不仅较团头鲂肉质细嫩、营养价值高等，而且还有团头鲂的食性杂、养殖成本低、性情温驯、易捕捞和活鱼上市等特点，但对养殖水质要求较高，其管理水平要求较高。翘嘴鲌和三角鲂在染色体数、生殖、外形、食性及抗逆性等方面互补性强，其杂交子代具有明显的超亲杂交优势，市场前景好。
常规使用鉴定杂交鱼类的方面，主要从形态学方面进行鉴定。然而，形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，翘嘴鲌、三角鲂和杂交子代形态相似，在育种过程中特别是苗种阶段，传统的形态学鉴别方法很难准确辨别亲本和杂交子代，因此容易造成种质混杂。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用ITS1基因的分子标记便很容易区别翘嘴鲌、三角鲂及杂交子代的方法。
发明内容
本发明提供一种在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用ITS1基因的分子标记便很容易区别翘嘴鲌、三角鲂及杂交子代的方法。
本发明根据GenBank上公布的团头鲂以及翘嘴鲌的ITS1序列，设计通用引物对1扩增翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代的ITS1部分序列，克隆测序得到翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代的ITS1部分序列，在此基础上再设计通用引物对2，建立基于ITS1基因的分子标记来鉴定翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。
本研究通过选择ITS1基因，该基因在翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代中的扩增片段存在显著的差异。设计一对通用引物，通过ITS1基因的扩增片段大小来鉴定翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。
本发明通过以下技术方案实现：
一种克隆翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代ITS1基因部分序列的方法，其步骤如下：
提取翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代鳍条的基因组DNA，设计通用引物对1、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，获得翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代ITS1部分序列。结果显示三角鲂ITS1序列长度为399bp，翘嘴鲌的ITS1序列长度为445bp，而杂交子代的ITS1序列同时含有399bp和445bp的片段；
一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，其步骤如下：
抽提鳍条基因组DNA，在已知ITS1序列的基础上设计通用引物对2，以翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物在2％的琼脂糖上凝胶电泳，根据扩增片段大小来区分三个品种，其中201bp片段为三角鲂，256bp片段为翘嘴鲌，而杂交子代同时具有201bp片段和256bp片段。
所述的方法，ITS1基因部分序列克隆的PCR反应是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200umol/L在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃3min、30循环(94℃30s、57℃30s、72℃30s)、72℃延长5min，4℃度保存。
所述的方法，翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的PCR反应是含有40ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200umol/L在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的10μl反应体系中进行，反应条件是95℃3min、30循环(94℃25s、59℃25s、72℃25s)、72℃延长5min，4℃度保存。
本发明的有益之处在于：
本研究通过选择ITS1基因，该基因在翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代中的序列长度存在显著的差异。设计一对通用的引物，通过PCR扩增ITS1基因，凝胶电泳，比较片段大小来鉴定翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。本发明所建立的方法具有特异性强、可信度高，可应用于翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的品种鉴定。
附图说明
图1为三角鲂、翘嘴鲌及其杂交子代ITS1基因的电泳图。
具体实施方式
实施例1：
翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代来自浙江省淡水水产研究所综合实验基地，根据GenBank上公布的团头鲂以及翘嘴鲌的ITS1序列设计通用引物对1，能扩增翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代ITS1的部分序列，通用引物对1引物见表1。
表1扩增翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代ITS1部分序列的通用引物对1
引物 序列(5’-3’) 碱基数 退火温度
正向 AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG 22 49.9℃
反向 GCACGAGCCGAGTGATCCA 19 56.8℃
PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/LMgCl2，200umol/L在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃3min、30循环(94℃30s、57℃30s、72℃30s)、72℃延长5min，4℃度保存。扩增的PCR产物纯化后连接到pMD19-T载体，转化到感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑选阳性质粒，送往上海博尚生物技术有限公司测序。DNA序列用Blast软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行分析。三角鲂ITS1序列长度为399bp,翘嘴鲌ITS1序列长度为445bp，而杂交子代的序列同时含有399bp，445bp这两种序列。翘嘴鲌和三角鲂ITS1部分序列分别如下所示：
AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAAGGTTTCGTCCTCCGAGACTTTGGGGGGGGCCGCTCCGGCGTGCCCTCCCCTCGATTTTTTTGGTGGGTCGACCCGACCCGGGGGAGGCCGCTCCGGCGTGCCTTCTTCCCCCCAGAAAGGCGGTGAAGCACAGTGGCGAGAGACACCCCCGACGGGTACCCGCCTGGCTCCCTCCTCCTCCTTGGAGGAGGAGGGGGACCGTGGGTTTAAAGACCCCCTCCCCGGAGGGGGCGCCCGTCCTGGGGTCTCGCCGCTTATTTTTTTTCCCCCAAAAACCTTTGTCTTTGTTGTTGGCCAAAAAAACACTCAAGTGTATACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGC
序列1三角鲂ITS1部分序列
注：分子鉴定通用引物对2用下划线表示。
AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAAGGCAGAGCCTCCTGAGACTTTGGGGGGGGCCGCTCCGGCGTGCCCTCCCGTCGATTTGGTGGGTTGACCGAACCGGGAAGGCCGCTCCGGCGTGCCTTCCCCCGAAAAGGCGATCGAATGCCTCTCCCCTCGGGGTAACAGCCGAGGTGGTTGGAAATCGATAACGCCTTTGCTTCGGTGAAGCGCGGTGGCGAGAGACACCCCCGACGGGTACCCGCCTGGCTCCCTCCTCGGAGGGGGACCGTGGGTTTAAAGACTCCCTCCCCGGAGGGGGCGCCCGTCCTGGGGTCTCGCCGCTTATTTTTTTTTTTCCCCAAAAACCTTTGTCTTTGTTGTTGGCCAAAAAACACACTCAAGTGTATACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGC
序列2翘嘴鲌ITS1部分序列
注：分子鉴定通用引物对2用下划线表示。
实施例2：
根据实施例1得到的翘嘴鲌和三角鲂的ITS1部分序列设计通用引物对2，能扩增翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代ITS1的部分序列，通用引物对2见表2。
表2扩增翘嘴鲌、三角鲂以及杂交子代ITS1部分序列的通用引物对2
从翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的鳍条中提取基因组DNA，每个品种30尾鱼，共90尾。PCR是在含有40ng DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200umol/L在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的10μl反应体系中进行，反应条件是95℃3min、30循环(94℃25s、59℃25s、72℃25s)、72℃延长5min，4℃度保存。PCR产物在2％的琼脂糖凝胶电泳，三角鲂片段为256bp、翘嘴鲌为201bp，而其杂交子代则含有256bp和201bp两条条带。图1为翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的ITS1电泳图片，每个品种8尾鱼。图1说明M为DL1000(takara)，从M开始，从左到右，三角鲂、杂交子代，翘嘴鲌。三角鲂片段比翘嘴鲌小。
综上，本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用ITS1基因的分子标记便很容易区别翘嘴鲌、三角鲂及杂交子代的方法。本研究通过选择ITS1基因，该基因在翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代中的序列长度存在显著的差异。设计一对通用的引物，通过PCR扩增ITS1基因，凝胶电泳，比较片段大小来鉴定翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。本发明所建立的方法具有特异性强、可信度高，可应用于翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的品种鉴定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）分别提取翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的基因组DNA；
（2）以ITS1基因设计通用引物对1，进行PCR扩增，克隆测序获得翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代的ITS1基因部分序列；
（3）根据得到的ITS1基因序列，设计通用引物对2进行PCR扩增，根据凝胶电泳产物片段大小来判断翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代。
2.产物片段256bp为三角鲂，产物片段201bp为翘嘴鲌，产物片段同时含有256bp和201bp则为杂交子代。
3.根据权利要求1所述的翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，其特征在于：杂交子代同时含有翘嘴鲌、三角鲂ITS1基因序列，如实施例1中序列1、序列2所示。
4.根据权利要求1所述的翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，其特征在于：所述的克隆通用引物对1见表1，分子鉴定通用引物对2见表2。
5.根据权利要求1所述的翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，其特征在于：所述的第2步中PCR扩增的程序是：95℃ 3min、30循环（94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s）、72℃延长5min，4℃度保存。
6.根据权利要求1所述的翘嘴鲌、三角鲂及其杂交子代分子鉴定的方法，其特征在于：所述的在第3步中，PCR扩增的程序是：95℃ 3min、30循环（94℃ 25s、59℃ 25s、72℃ 25s）、72℃延长5min，4℃度保存。
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