CN108034731A - 一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法 - Google Patents
一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，首先提取两种舌鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，最后对两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为桑给巴尔舌鳎，条带短的为尼日利亚舌鳎。有益效果为：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别尼日利亚舌鳎与桑给巴尔舌鳎，通过凝胶电泳比较两种舌鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法。
背景技术
桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎同属鲽形目舌鳎科舌鳎属，形态上非常相近，很难通过传统形态特征进行区分，从而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。因此寻找区分尼日利亚舌鳎和桑给巴尔舌鳎的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速高效地鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，过程为：采用标准酚-氯仿法提取两种舌鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，收集两种扩增产物在1％-1.2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为桑给巴尔舌鳎，条带短的为尼日利亚舌鳎。通过凝胶电泳比较两种舌鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
作为优选，扩增反应所采用的正向引物序列为：TCGGCRACGGCCYTGGCGGAG，反向引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG。所用的引物是基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列设计得到，特异性极强，所扩增的ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS1长度差异非常明显，大大提高了鉴别方法的准确性。
作为优选，扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物，0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL rTaq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。该扩增体系为扩增提供了最优的酸碱度和离子浓度，使聚合酶的活性高，提高了扩增产物的收率。
作为优选，扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响rTaq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别尼日利亚舌鳎与桑给巴尔舌鳎，通过凝胶电泳比较两种舌鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
附图说明
图1为扩增产物的电泳条带，M为DNA Marker，泳道1、2为扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图作进一步详细描述：
实施例1：
一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：用标准酚-氯仿法提取两种舌鳎的基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存；
2)扩增反应：分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物，0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL rTaq聚合酶混合，加双蒸水至25μL，扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min，其中，正向引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，反向引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG；
3)电泳分析：取两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，泳道2条带长，为桑给巴尔舌鳎；泳道1条带短，为尼日利亚舌鳎。
4)验证：获取已知种类的桑给巴尔舌鳎，重复步骤1)和步骤2)，对扩增产物进行纯化测序，所得序列为：TCGGCAACGGCCTTGGCGGAGTGCCGAGAAGACGATCAAACTTGACTATCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGGTCGTTCGGTGGCCCGCGGTCACACGCAGCCACGGACACACGCACGTACCCCCGCTGCGGGCGGCGGCTGTGCGCGGGCGGCGGGACGAGCTCGTCTCGTCTCTGCCTCTCGTGTGCACCGTCGTCCCCGGGAGTGGTAGGCGGGAGAGGAGGTCTGCCAGCCACGGCTGTGCATCTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTGGCTCCCCAAACTGGTCCGGGCCCCGTCGATGTCTTCTCCGAGGACGGGTGTGGGCCCACCCCCAAGGAACCCAGACCCAGCGTGGATCGCTGGCCCTTTGCGGGGCTCGCGTGACGCGCGCCGGACGGGTACCCAACTCTCCGTCCTCCCGCGGAGGACGGCGGGGGGTTCAATATCTCCGCTGTCGCTCGCGCAAATGCGCGTGGGCGGCCCGGAGTGCCCGCCCGGTTCGGCGAGGCGTGCCTCGGGCACGCTTCACCCACCGACACCGACGCAGAGGTGGAGGAAACGAAAAAGAACAAAACCAATGGAAACACTGTGGCCTTTTGCAAAGGGTGACGCGCGGCGTCACATACAAGAGCGTCTACAGCTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGAACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATCGACTCTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCTTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTT。
获取已知种类的尼日利亚舌鳎，重复步骤1)和步骤2)，对扩增产物进行纯化测序，所得序列为：TCGGCGACGGCCCTGGCGGAGCGCCGAGAAGACGATCAAACTTGACTATCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGGTGAACGCCGGCGCCGCCAAGGGGTTAAACCTCCCCCCACGCGCGGTACCAGCGAGACCAGCAGCCTCGCGGACGGAGGCGTGCGTGCGTGGCAGCCGCCGCGTGCACGCCTCCGTCCCCGGGAGGGACGAGATTCGGCCTGCCGCGCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCCAACCTGGTCCGGGCCTCGCCGTCCTCACCGAGGACGGGTTGCGGGCCCGCCCCATCGGAACCCAGACCCAGCGCCGATCGGGACTCTCCGTGAAGCGCGCCGGACGGGTACCCAACTCTCCGTTCTCCCCCGGAGGACGGCGGGGGGTTCAATATCTCCGCTCTCGCGCGCGCTCGACCGTCCACGACGACGGTGGCGCGCGCGGCCCGGAGTGCCCGTTCGGTTTTGTGTGCCGCCCCCGGCACCTGTTGCCACCTCCGAATGTTTTTGAAGGAAAGGCGTGGCCAGTTTTTTTTTTCCGAAAGCGTAGCAGCGTCTACAACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTCGTGCGTCGATGAAGAACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATCGACATTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCTTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCGCTT。由上可知，桑给巴尔舌鳎的扩增产物长于尼日利亚舌鳎的扩增产物，因此，步骤3)所得结论正确
实施例2：
一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：用标准酚-氯仿法提取两种舌鳎的基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存；
2)扩增反应：分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物，0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL rTaq聚合酶混合，加双蒸水至25μL，再加入1.6ng 2-氯-5-硝基苯甲酸和0.1ng二苯基甲醇，扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min，其中，正向引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，反向引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG，所加入的2-氯-5-硝基苯甲酸、二苯基甲醇和镁离子具有协同作用，不仅能够极大地激活Taq聚合酶的活性，提高扩增反应效率，缩短鉴别的时间，而且能够钝化DNA模板所含有的PCR抑制物，避免了假阴性结果的出现，使鉴别结果更加准确；
3)电泳分析：取两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，条带长的为桑给巴尔舌鳎，条带短的为尼日利亚舌鳎。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 尼日利亚舌鳎(Cynoglossus browni)
<400> 1
tcggcgacgg ccctggcgga gcgccgagaa gacgatcaaa cttgactatc tagaggaagt 60
aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattacc ggtgaacgcc 120
ggcgccgcca aggggttaaa cctcccccca cgcgcggtac cagcgagacc agcagcctcg 180
cggacggagg cgtgcgtgcg tggcagccgc cgcgtgcacg cctccgtccc cgggagggac 240
gagattcggc ctgccgcgcc tctccctctc tctctctcca acctggtccg ggcctcgccg 300
tcctcaccga ggacgggttg cgggcccgcc ccatcggaac ccagacccag cgccgatcgg 360
gactctccgt gaagcgcgcc ggacgggtac ccaactctcc gttctccccc ggaggacggc 420
ggggggttca atatctccgc tctcgcgcgc gctcgaccgt ccacgacgac ggtggcgcgc 480
gcggcccgga gtgcccgttc ggttttgtgt gccgcccccg gcacctgttg ccacctccga 540
atgtttttga aggaaaggcg tggccagttt tttttttccg aaagcgtagc agcgtctaca 600
actcttagcg gtggatcact cggctcgtgc gtcgatgaag aacgcagcta gctgcgagaa 660
ctaatgtgaa ttgcaggaca cattgatcat cgacatttcg aacgcacctt gcggccccgg 720
gttcttcccg gggctacgcc tgtctgaggg tcgctt 756
<210> 2
<211> 844
<212> DNA
<213> 桑给巴尔舌鳎(Cynoglossus zanzibarensis)
<400> 2
tcggcaacgg ccttggcgga gtgccgagaa gacgatcaaa cttgactatc tagaggaagt 60
aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattacc ggtcgttcgg 120
tggcccgcgg tcacacgcag ccacggacac acgcacgtac ccccgctgcg ggcggcggct 180
gtgcgcgggc ggcgggacga gctcgtctcg tctctgcctc tcgtgtgcac cgtcgtcccc 240
gggagtggta ggcgggagag gaggtctgcc agccacggct gtgcatctct ctctctctct 300
ccctccctcc ctctctctgg ctccccaaac tggtccgggc cccgtcgatg tcttctccga 360
ggacgggtgt gggcccaccc ccaaggaacc cagacccagc gtggatcgct ggccctttgc 420
ggggctcgcg tgacgcgcgc cggacgggta cccaactctc cgtcctcccg cggaggacgg 480
cggggggttc aatatctccg ctgtcgctcg cgcaaatgcg cgtgggcggc ccggagtgcc 540
cgcccggttc ggcgaggcgt gcctcgggca cgcttcaccc accgacaccg acgcagaggt 600
ggaggaaacg aaaaagaaca aaaccaatgg aaacactgtg gccttttgca aagggtgacg 660
cgcggcgtca catacaagag cgtctacagc tcttagcggt ggatcactcg gctcgtgcgt 720
cgatgaagaa cgcagctagc tgcgagaact aatgtgaatt gcaggacaca ttgatcatcg 780
actcttcgaa cgcaccttgc ggccccgggt tcttcccggg gctacgcctg tctgagggtc 840
gctt 844
Claims (6)
1.一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述方法的过程为：提取两种舌鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，对两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为桑给巴尔舌鳎，条带短的为尼日利亚舌鳎。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述扩增反应所用的正向引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，反向引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG。
3. 根据权利要求1所述的一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的正向引物，0.5μL浓度为10μmol/L的反向引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL rTaq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别桑给巴尔舌鳎和尼日利亚舌鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述基因组DNA的提取采用标准酚-氯仿法。
6.根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的浓度为1％-1.2％。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180515 |
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