CN106636412A - 一种采用its序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法 - Google Patents

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胡汉志
周少英
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Abstract

本发明公开了一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，包括以下步骤：(1)选取黄檀属和紫檀属木种，采用核酸抽提试剂盒抽提，获得黄檀属和紫檀属木种的DNA；(2)以步骤(1)获得的DNA为模板，依次加入引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，得到PCR产物，将PCR产物进行测序，获得ITS序列；(3)将步骤(2)得到的ITS序列，进行拼接和裁剪后比对后发现变异位点，从变异位点中筛选出能鉴别黄檀属和紫檀属的特征位点；(4)采用MEGA6.0软件构建系统进化树，结果表明，ITS的序列信息能分辨出黄檀属和紫檀属的木种。该方法可以将ITS序列作为DNA条形码，识别黄檀属和紫檀属木种。

Description

一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法
技术领域
本发明属于木种鉴定技术领域，具体涉及一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法。
背景技术
红木作为较为珍贵的一类木材，因具有优良的耐腐性、稳定性和视觉特性而被人们所青睐，而随着优质的红木资源不断减少，价格上的巨大差异，市场上以假乱真、以次充好的现象较为普遍，因而对木种进行快速准确的鉴定显得尤为重要。传统的木材识别主要结合木材的宏观构造和微观构造进行，前者主要用于生产现场，但不够准确，一般只能鉴定到大类；后者则比较准确，但需要涉及的专业知识较多，对设备和技术力量的要求较高，且流程需要经过制片，较为复杂麻烦。
DNA条形码(DNA Barcode)的概念最早于2003年提出(Hebert PD et al.,2003)，原理是使用一段标准的DNA片段，类似于使用条形码扫描来不同的商品的原理对物种进行快速、准确的鉴定。目前条形码的研究与应用已经迅速发展成为一项全新物种鉴定技术，为解决传统分类学实际工作中遇到的难题提供了新渠道。2009年在墨西哥城召开了第三届国际DNA条形码大会中决定将叶绿体基因片段的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL)、成熟酶K蛋白(maturaseK，matK)、trnH和psbA间隔区序列(trnH-psbA Intergenic Spacer Region，trnH-psbA)和核基因片段核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers，ITS)作为植物DNA条形码的候选序列。
DNA条形码已经广泛应用到生物多样性的鉴定检测中，如出入境检验检疫行业标准SN/T 2051-2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》中检测的靶标基因就是动物DNA条形码基因片段COI基因。但和动物条形码不同的是，因为进化速率的不同，目前对植物条形码还没有一个确切的靶标基因或靶标基因的组合，特别是对于某些特殊的物种或种属的鉴定上。
近年来随着分子生物学和DNA条形码技术的发展，一些研究者开始尝试利用这一检测手段鉴定木种树种。伏建国等(2013)成功在黄檀属树种中克隆得到一些成熟蛋白的基因(maturase K，matK)，并作为植物DNA条形码，成功鉴别黄檀属中各个木种。
ITS片段是编码核糖体RNA基因重复区内的中度保守序列，可分为ITS1和ITS2两部分。ITS序列既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度保守性，因此提供了丰富的遗传信息，易区分近缘类群。陈士林对涵盖接近200个科800个属的超4800种植物的ITS2序列进行大范围的研究，得出ITS序列在药用植物及其近缘种的属和物种鉴定方面具有很大优势。
因此，本发明拟研究采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种，确定其能否作为DNA条形码识别植物物种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，该方法可以将ITS序列作为DNA条形码，识别黄檀属和紫檀属木种。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，包括以下步骤：
(1)选取黄檀属和紫檀属木种，采用核酸抽提试剂盒抽提，获得黄檀属和紫檀属木种的DNA；
(2)以步骤(1)获得的DNA为模板，依次加入引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，扩增反应程序为：94℃变性3min；94℃0.25min，52℃0.5min，72℃0.5min，30个循环；72℃10min，采用PCR回收试剂盒纯化，得到PCR产物，将PCR产物进行测序，获得ITS序列，其大小为323bp；
(3)将步骤(2)得到的ITS序列，进行拼接和裁剪后比对后发现变异位点，从变异位点中筛选出能鉴别黄檀属和紫檀属的特征位点；
(4)采用NJ算法和MEGA6.0软件构建系统进化树，结果表明，ITS的序列信息能分辨出黄檀属和紫檀属的木种。
在上述采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法中：
步骤(1)中所述的黄檀属和紫檀属木种包括赛州黄檀Dalbergia cearensis、交趾黄檀Dalbergia cochinchinensis、刀状黑黄檀Dalbergia cultrata、阔叶黄檀Dalbergialatifolia、东非黑黄檀Dalbergia melanoxylon、降香黄檀Dalbergia odorifera、奥氏黄檀Dalbergia oliveri、亚马孙黄檀Dalbergia spruceana、安达曼紫檀Pterocarpusdalbergioides、刺猬紫檀Pterocarpus erinaceus、印度紫檀Pterocarpus indicus、大果紫檀Pterocarpus macrocarpus、檀香紫檀Pterocarpus santalinus和染料紫檀Pterocarpus tinctorius。
步骤(2)中PCR扩增时的反应体系包括：引物ITS4 2μL、引物ITS5 2μL、浓度为10mM的dNTP 5μL、10×buffer 5μL、ddH2O 35μL，浓度为5U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.25μL。
步骤(3)中采用MUSCLE进行拼接，采用Bioedit v.7.0.9进行裁剪。
本发明具有以下优点：本发明以蝶形花科黄檀属和紫檀属的树种为材料，进行植物条形码ITS测序，PCR结果显示ITS的扩增成功率达到100％，同源性分析结果表明各物种中的ITS序列变异显著，共找到32个可以用来区分物种的变异位点，系统进化树的结果表明利用ITS序列进行物种水平鉴定成功率达100％，能够作为DNA条形码识别植物物种。
附图说明
图1是实施例1中木材样品ITS序列的PCR电泳图谱；
图2是实施例1中木材样品ITS的序列的变异位点；
图3是实施例1中基于ITS序列构建系统进化树(NJ树)。
具体实施方式
本实施例提供的采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，包括以下步骤：
1.1材料广东产品质量监督检验研究院木种博物馆收藏的蝶形花科黄檀属和紫檀属的木种，共14个木种14个树种(赛州黄檀、交趾黄檀、刀状黑黄檀、阔叶黄檀、东非黑黄檀、降香黄檀、奥氏黄檀、亚马孙黄檀、安达曼紫檀、刺猬紫檀、印度紫檀、大果紫檀、檀香紫檀和染料紫檀)。
1.2总DNA的提取木块研磨成粉状，取适量的样品(约0.1g)，参照核酸抽提试剂盒(Solar，USA)使用说明进行操作。
1.3引物设计使用通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')。
1.4 DNA扩增取1μL1.1中制备的总DNA模板(100ng)，依次加入引物ITS4 2μL、3’引物ITS5 2μL、dNTP(10mM)5μL、10×buffer 5μL、ddH2O 35μL，最后加入Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，按如下程序进行PCR反应：94℃变性3min；94℃0.25min，52℃0.5min，72℃0.5min，30个循环；72℃10min。PCR产物采用PCR回收试剂盒(Solar，USA)纯化。
从ITS序列的PCR电泳图谱(图1)可以看出，各样品的ITS序列的PCR扩增结果都比较理想，可看到清晰规则的目的条带，无杂带和拖尾现象。
1.5测序纯化产物由深圳华大基因公司测序，采用双向测序；经测序，得到约323bp长度的序列。
1.6序列分析利用MUSCLE对序列进行拼接，用Bioedit v.7.0.9对序列进行裁剪，利用MEGA6.0进行系统进化树的构建，采用Neighbour-joining(NJ)法，bootstrap重复1000次。
将得到的序列利用MUSCLE进行拼接，用Bioedit v.7.0.9进行裁剪后比对。比对结果发现了94个变异位点，而可用于鉴别物种的特征位点则有32个(序列见图2)。如117bp：C、145bp：G、176bp：C、216bp：C、246bp：G、247bp：T、270bp：G、292bp：A和307bp：A可用于区分黄檀属和紫檀属的物种；而136bp：C、224bp：G、248bp：C和253bp：G则可能可以用于鉴别名贵木材—降香黄檀。
使用MEGA6.0构建系统进化树(图3)，算法为Neighbour-joining(NJ)法，bootstrap重复1000次。由图3可以看出，系统进化树能把黄檀属和紫檀属显著地区分开，且同一属内也能较好地区分，表明ITS的确可以作为植物条形码应用到蝶形花科树种的鉴定。在黄檀属中，阔叶黄檀和东非黑黄檀较为近缘，交趾黄檀与奥氏黄檀较为亲缘，降香黄檀与赛州黄檀较为亲缘；在紫檀属中，刺猬紫檀与紫檀属物种相对远缘，而名贵的檀香紫檀与安达曼紫檀、印度紫檀和大果紫檀较为近缘。
本发明以蝶形花科黄檀属和紫檀属的14种木种为材料，扩增得到了其相应的ITS序列，系统进化树结果表明，ITS的序列信息能较好分辨出黄檀属和紫檀属的木种，也能很好分辨出属内各个树种。
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)选取黄檀属和紫檀属木种，采用核酸抽提试剂盒抽提，获得黄檀属和紫檀属木种的DNA；
(2)以步骤(1)获得的DNA为模板，依次加入引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，扩增反应程序为：94℃变性3min；94℃0.25min，52℃0.5min，72℃0.5min，30个循环；72℃10min，采用PCR回收试剂盒纯化，得到PCR产物，将PCR产物进行测序，获得ITS序列，其大小为323bp；
(3)将步骤(2)得到的ITS序列，进行拼接和裁剪后比对后发现变异位点，从变异位点中筛选出能鉴别黄檀属和紫檀属的特征位点；
(4)采用MEGA6.0软件构建系统进化树，结果表明，ITS的序列信息能分辨出黄檀属和紫檀属的木种。
2.根据权利要求1所述的采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，其特征是：步骤(1)中所述的黄檀属和紫檀属木种包括赛州黄檀Dalbergia cearensis、交趾黄檀Dalbergia cochinchinensis、刀状黑黄檀Dalbergia cultrata、阔叶黄檀Dalbergialatifolia、东非黑黄檀Dalbergia melanoxylon、降香黄檀Dalbergia odorifera、奥氏黄檀Dalbergia oliveri、亚马孙黄檀Dalbergia spruceana、安达曼紫檀Pterocarpusdalbergioides、刺猬紫檀Pterocarpus erinaceus、印度紫檀Pterocarpus indicus、大果紫檀Pterocarpus macrocarpus、檀香紫檀Pterocarpus santalinus和染料紫檀Pterocarpus tinctorius。
3.根据权利要求1所述的采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时的反应体系包括：引物ITS4 2μL、引物ITS52μL、浓度为10mM的dNTP 5μL、10×buffer 5μL、ddH2O 35μL，浓度为5U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.25μL。
4.根据权利要求1所述的采用ITS序列识别黄檀属和紫檀属木种的方法，其特征是：步骤(3)中采用MUSCLE进行拼接，采用Bioedit v.7.0.9进行裁剪。
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