CN108148913A - 一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，首先提取两种条鳎的基因组DNA，再分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，最后对两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为缨鳞条鳎，条带短的为日本条鳎。有益效果为：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎，通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。

Description

一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法。
背景技术
日本条鳎和缨鳞条鳎同属鲽形目鳎科条鳎属，形态上非常相近，主要通过尾鳍后半部黄色纵纹或斑点以及眼间隔是否具有鳞片进行区分。尾鳍后半部具有黄色纵纹，且眼间有鳞片的为日本条鳎，尾鳍后半部具有黄色斑点，且眼间无鳞的为缨鳞条鳎。但是由于其离水后颜色很容易就褪去，且鳞片也很容易脱落，导致两者很难通过形态特征进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。因此寻找区分日本条鳎和缨鳞条鳎的可靠标准，从混杂的种质中鉴别、分离种质成为一个迫不及待的问题。这将有助于解决种质混杂等问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎的分子生物学方法，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供了技术支撑。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，过程为：采用标准酚-氯仿法提取两种条鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，将两种扩增产物在1％-1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较扩增产物长度，条带长的为缨鳞条鳎，条带短的为日本条鳎，其中扩增所采用的上游引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，下游引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG。通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
作为优选，扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。该扩增体系为扩增提供了最优的酸碱度和离子浓度，使聚合酶的活性高，提高了扩增产物的收率。
作为优选，扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响Taq酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所公开的方法能够快捷高效地鉴别日本条鳎与缨鳞条鳎，通过凝胶电泳比较两种条鳎扩增产物的长度进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的提高了工作效率；本发明所用的引物是基于核糖体内转录间隔区1(ITS1)两端保守的18S rDNA和5.8SrDNA序列设计得到，特异性极强，所扩增的ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS1长度差异非常明显，大大提高了鉴别方法的准确性。
附图说明
图1为扩增产物的电泳条带，M为DNA Marker，泳道1、2为扩增产物的电泳结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图作进一步详细描述：
实施例1：
一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：用标准酚-氯仿法提取两种条鳎的基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存；
2)扩增反应：分别以提取的两种条鳎的基因组DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL，扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min，其中，上游引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，下游引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG；
3)电泳分析：取两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，若扩增产物与泳道2对应，说明所扩增的DNA片段条带长，为缨鳞条鳎；若扩增产物与泳道1对应，说明所扩增的DNA片段条带短，为日本条鳎；
4)验证：获取已知种类的日本条鳎，重复步骤1)和步骤2)，对扩增产物进行纯化测序，所得序列为：TACCGATTGGATGGTTTAGTGAGGTCCTCGGATCGGCCCCGCCGGGGTCGGTCACGGCCCTGGCGGAGCGCCGAGAAGACGATCAAACTTGACTATCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGCGTGCCAGGCGGGTGCCGGGGTCGCAAGGCCTCCCACTCGGTCCTGCCAGACGTCCAGGGCGCTTAGGGCGCGAGGGGCTCCACAGCCCCCCGGGCCCGAGGCGAGGGGGGGAGCGGCGCCTCCCGCTCCCTCTCTCTTTCCGTCTCCCTCTGGTCCGGGCAATGCCCGAGAGGGGCCGCCCGCCCCTCTAACGCCGGGCTTGCCGCCGGAACCTCTAACCCAGCGCGGTGCGGGGGCGAACGCCGCCCTCCCCGCGCGCCGACCGGGTACCCAACTCTCCACCCTCCCTCGGAGGGCGGCGGGGGGTTCAATGTCTCTCCGGAGCGCCCGGCCGGTGAAGCTGTCCCCCAAAAACCGTGAAACGCACAGACGCCGTTGGCAGCTTGGCAAACGTGAAGGAAAAGAGAAAAGCACAAAACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCTCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCG。
获取已知种类的缨鳞条鳎，重复步骤1)和步骤2)，对扩增产物进行纯化测序，所得序列为：TACCGATTGGATGGTTTAGTGAGGTCCTCGGATCGGCCCCGCCGGGGTCGGTCACGGCCCTGGCGGAGCGCCGAGAAGACGATCAAACTTGACTATCTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGCGCGACAGGCGGGTGCCCCTTACCCGGCACTCGGCCTGCGCCCACACCCCACGGACGCTTAGGGTGCCTCCGCGCCCGAGGCAAGGCAGGGAGAGAGGCGCGCTCGAGCGGGCCTCCCTCCGCCTCCAACCCCACCTCCCCTTGGTCCGGGGGCCGGGTTTCCCGCGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATAGCGAGAGCGAGCGAGAGCTCACTCAGTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCACTCTCTCAGACCGGGCTCGACCCCAAACACCACCGGAACCAATGTCCCACAGCGCGGGCGGGTGGACGGCCGGTTTTCGGCCGGCCCACCTACCCGCGCGCCGACCGGGTACCCAACTCTCCACGCTCCCTCGGAGGGTGGCGGGGGGTTCAATGTCTCTACGGAGCGCCCGGACGGTTAAGACTGTCCGAGGACAGAGGAACCGAAACCGTGAAACCCCGTTGGCGGCTTGGCAAGCAAAAACAAAAAAAACAAAGGAAAAAATGAACAACTCTTAGCGGTGGATCACTTGGCTCGTGCGTCGATGAAGGACGCAGCTAGCTGCGAGAACTAATGTGAATTGCAGGACACATTGATCATTGACACTTCGAACGCACCTTGCGGCCCCGGGTTCCTCCCGGGGCTACGCCTGTCTGAGGGTCG。由上可知，缨鳞条鳎的扩增产物长于日本条鳎的扩增产物，因此，步骤3)所得结论正确。
实施例2：
一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：用标准酚-氯仿法提取两种条鳎的基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存；
2)扩增反应：分别以提取的两种条鳎的基因组DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL，再加入1.6ng 2-氯-5-硝基苯甲酸和0.1ng二苯基甲醇，扩增反应在PTC-200型PCR仪上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min，其中，上游引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，下游引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG，2-氯-5-硝基苯甲酸、二苯基甲醇和镁离子具有协同作用，不仅能够极大地激活Taq聚合酶的活性，提高扩增反应效率，缩短鉴别的时间，而且能够钝化DNA模板所含有的PCR抑制物，避免了假阴性结果的出现，使鉴别结果更加准确；
3)电泳分析：取两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，条带长的为缨鳞条鳎，条带短的为日本条鳎。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 734
<212> DNA
<213> 日本条鳎(Zebrias japonicus)
<400> 1
taccgattgg atggtttagt gaggtcctcg gatcggcccc gccggggtcg gtcacggccc 60
tggcggagcg ccgagaagac gatcaaactt gactatctag aggaagtaaa agtcgtaaca 120
aggtttccgt aggtgaacct gcggaaggat cattaccgag cgtgccaggc gggtgccggg 180
gtcgcaaggc ctcccactcg gtcctgccag acgtccaggg cgcttagggc gcgaggggct 240
ccacagcccc ccgggcccga ggcgaggggg ggagcggcgc ctcccgctcc ctctctcttt 300
ccgtctccct ctggtccggg caatgcccga gaggggccgc ccgcccctct aacgccgggc 360
ttgccgccgg aacctctaac ccagcgcggt gcgggggcga acgccgccct ccccgcgcgc 420
cgaccgggta cccaactctc caccctccct cggagggcgg cggggggttc aatgtctctc 480
cggagcgccc ggccggtgaa gctgtccccc aaaaaccgtg aaacgcacag acgccgttgg 540
cagcttggca aacgtgaagg aaaagagaaa agcacaaaac aactcttagc ggtggatcac 600
ttggctcgtg cgtcgatgaa ggacgcagct agctgcgaga actaatgtga attgcaggac 660
acattgatca ttgacacttc gaacgcacct tgcggcctcg ggttcctccc ggggctacgc 720
ctgtctgagg gtcg 734
<210> 2
<211> 834
<212> DNA
<213> 缨鳞条鳎(Zebrias crossolepis)
<400> 2
taccgattgg atggtttagt gaggtcctcg gatcggcccc gccggggtcg gtcacggccc 60
tggcggagcg ccgagaagac gatcaaactt gactatctag aggaagtaaa agtcgtaaca 120
aggtttccgt aggtgaacct gcggaaggat cattaccgag cgcgacaggc gggtgcccct 180
tacccggcac tcggcctgcg cccacacccc acggacgctt agggtgcctc cgcgcccgag 240
gcaaggcagg gagagaggcg cgctcgagcg ggcctccctc cgcctccaac cccacctccc 300
cttggtccgg gggccgggtt tcccgcggga gagagagaga gagagagaga gagagatagc 360
gagagcgagc gagagctcac tcagtcactc actcactcac tcactcactc actctctcag 420
accgggctcg accccaaaca ccaccggaac caatgtccca cagcgcgggc gggtggacgg 480
ccggttttcg gccggcccac ctacccgcgc gccgaccggg tacccaactc tccacgctcc 540
ctcggagggt ggcggggggt tcaatgtctc tacggagcgc ccggacggtt aagactgtcc 600
gaggacagag gaaccgaaac cgtgaaaccc cgttggcggc ttggcaagca aaaacaaaaa 660
aaacaaagga aaaaatgaac aactcttagc ggtggatcac ttggctcgtg cgtcgatgaa 720
ggacgcagct agctgcgaga actaatgtga attgcaggac acattgatca ttgacacttc 780
gaacgcacct tgcggccccg ggttcctccc ggggctacgc ctgtctgagg gtcg 834

Claims (5)

1.一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述方法的过程为：提取两种条鳎的基因组DNA，分别以提取的DNA为模板进行核糖体内转录间隔区1（ITS1）扩增反应，对两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，比较扩增产物长度，条带长度值大的为缨鳞条鳎，条带短长度值小的为日本条鳎，其中扩增所采用的上游引物序列为：TACCGATTGGATGGTTTAG，下游引物序列为：AAGCGACCCTCAGACAGGCG。
2. 根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述扩增反应体系为：取100ng模板DNA，0.5μL浓度为10μmol/L的上游引物，0.5μL浓度为10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL浓度为10mmol/L的dNTP，1.5μL浓度为25mmol/L的MgCl2，0.2μL Taq聚合酶混合，加双蒸水至25μL。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述基因组DNA的提取采用标准酚-氯仿法。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴别日本条鳎和缨鳞条鳎的分子生物学方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶的浓度为1％-1.5％。
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