CN103468672A - 一种快速鉴别棉属种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及棉属DNA条形码及快速准确的棉种鉴定方法。所述方法包括以下步骤：取材及总DNA的提取、PCR扩增、克隆及测序、序列比对。根据本发明的方法采用棉花叶绿体基因组特有引物对总DNA进行trnT-trnL和trnH-psbA序列的特异扩增，方便快捷，无需单独提取叶绿体DNA，作为棉属DNA条形码的trnT-trnL和trnH-psbA序列组合，长度适中，对棉种识别力高，能够快速地鉴定棉种，不依赖于传统鉴定分类经验，操作简便，准确性高。

Description

一种快速鉴别棉属种的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及棉属DNA条形码及快速鉴别棉属种的方法。

背景技术

随着全球环境、气候和能源等问题的突出，认识生物多样性是可持续发展战略的迫切需求，而对生物多样性保护和利用的基础则是对物种进行快速而准确地鉴定。DNA条形码技术(DNA barcoding)也应运而生，Paul Hebert（2003）首先提出DNAbarcode，指出DNA条形码技术是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段基于其在物种种间的多样性和种内的特异性而创建的一种新的物种分类识别系统，它可以对物种进行快速地鉴定。由于叶绿体基因序列保守性强，已经被广泛用来构建系统发育树和鉴定植物物种。DNA条形码技术具有操作简便、准确性高、快速高效等特点。对于传统的分类工作，不同物种需要采取不同的技术方法，繁琐而易出现错误，而DNA条形码的出现则简化了物种分类鉴定的过程，是一个较为通用的方法。DNA条形码成为传统物种鉴定的强有力补充，使得物种分类鉴定过程简化，不过度依赖传统分类经验。通过一个标准化、较短的基因片段序列变异来鉴定物种，特别是通过叶绿体序列片段的研究，使得DNA条形码成为生命科学和生物技术领域进展最迅速的学科前沿之一。

研究表明，线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochrome coxidase Ⅰ，CO Ⅰ）作为动物理想的DNA条形码，但对于植物，因其线粒体基因进化速率较慢，不宜用作DNA条形码，至今没有找到一个标准的DNA barcode。2007年在第二届国际条形码大会提出了7个候选片段，分别是rbcL、matK、trnH-psbA、rpoC1、rpoB、psbK-psbI和atpF-atpH。2009年生命条形码联盟（the Consortium for the Barcode of Life，CBOL）发表了一篇PNAS研究论文，提议将rbcL和matK基因的组合作为植物通用的DNA条形码，而将trnH-psbA序列作为候选条形码。随后的第三届国际DNA条形码大会正式声明将rbcL和matK基因的组合作为植物DNA核心条形码，提议trnH-psbA片段和核基因片段ITS为植物DNA条形码的补充条码。2011年，第四届国际DNA条形码大会围绕生物多样性式样、生态取证、系统学和分子进化安排了四个主题报告，并分组对DNA条形码数据在这四个方面的重要科学问题开展了深入讨论。继上届会议推荐了植物条形码后，正式推荐了ITS为真菌条形码。

但实际上目前建议的植物DNA条形码(例如rbcL和matK基因)由于其分子进化速率较慢，在种级水平上分辨率较低，并不通用于任何物种和任何分类阶元。常用条形码在通用性上存在的局限性使得我们在不同的科属种寻找不同的DNA barcode。理想的条形码必须具备一下条件：第一，通用性，即物种均含有此片段，而且序列片段两端相对保守的区域存在一对通用引物，可以容易地获得产物；第二可读性，能够双向测序，长度适中，序列不需要过多的人为编辑；第三，识别率，即鉴定能力，有足够的变异，较高的物种识别率，将物种区分开来。

条形码在通用性上存在的局限性使得我们在棉属内寻找合适的DNA barcode。对于棉属DNA条形码，即需要具备：具有一对通用的引物，能将其在所有棉种中都得到成功扩增；此片段长度适中，一次双向测序即可以获得，不需要过多编辑；具有较高的识别力，能够区分所有棉种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速而准确地鉴定棉种的方法。

本发明的再一目的是提供棉花叶绿体基因组序列用于DNA条形码的应用。

根据本发明，首先，寻找DNA条形码，通过分析已经测序的棉花叶绿体基因组序列，确定棉属DNA条形码为转运RNA T和L的基因间区(trnT-trnL)以及转运RNAH和编码D1蛋白质的psbA基因的基因间区（trnH-psbA）的序列组合（trnT-trnL+trnH-psbA），能够区分任何一个棉种。

根据本发明的技术方案，设计通用引物，根据条形码序列在两侧设计叶绿体特异引物TL和HA，并使得能够对所有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。

根据本发明的鉴定棉种的方法包括以下步骤：

根据本发明的方法包括以下步骤：

1）设计通用引物，根据条形码序列在两侧设计叶绿体特异引物TL和HA，并使得能够对所有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA；

2）取材及DNA的提取，取目的棉种叶片5g左右，利用CTAB法提取棉花总DNA；

3）PCR扩增，设计扩增程序，利用设计的通用引物（TL和HA）进行降落PCR扩增；

4）PCR产物检测及克隆测序，trnT-trnL目的片段约1500bp，HA目的片段约400bp，送菌液测序；

5）序列比对，参照条形码序列，去除测得序列的两端非目的片段序列，与DNA条形码进行比对，以确定棉种。

根据本发明的方法只需提取棉种总DNA，通过PCR法特异地扩增作为棉属DNA条形码的叶绿体序列片段组合trnT-trnL+HA，方便快捷，无需单独提取叶绿体DNA。

根据trnT-trnL+HA序列与已知条形码的比对，直接确定棉种，快速准确，且不依赖于传统鉴定分类经验，简化了鉴定过程。

附图说明

图1是棉属DNA条形码比对图（箭头指示显著的标记）；

图2是棉属DNA条形码的通用引物TL和HA的设计；

图3是实施例中九个未知棉种的PCR扩增trnT-trnL产物；

图4是实施例中九个未知棉种的PCR扩增trnH-psbA产物。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1二十个已知棉种的DNA条形码的获得

1材料和方法

1.1实验材料

实验材料是二十个已知棉种的叶片，分别编号1-20，来自于中国农业科学院棉花研究所，见下表：

1.2总DNA的提取

利用CTAB法对二十个棉种总DNA进行提取。纯化后的DNA用紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。DNA浓度稀释至60ng/μl左右，保存于4℃冰箱作为工作液使用。

1.3PCR扩增

设计降落PCR，利用通用引物进行扩增：所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。

50μl PCR反应体系：10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs5.0μl，MgSO₄2.0μl，总DNA2.0μl，引物F1.5μl，引物R1.5μl，KOD酶1.0μl，ddH2O32μl，混匀。然后94℃预变性5min；进行94℃30s、61℃退火30s（每次退火温度降1℃，共降6次）、68℃延伸2min（循环29圈）；最后68℃延伸5min，4℃保温。

1.4PCR产物检测及克隆测序

PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

载体连接转入感受态大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，将含有目的片段的菌液送上海生工生物工程股份有限公司，使用ABI仪进行测序。为保证测序的准确性，采用正反双向测序，且每个片段送三个样品作为重复。

1.5序列比对

三个重复序列比对，保证序列准确性。

2试验结果

参考陆地棉（NC_007944）和海岛棉（NC_008641）的叶绿体基因组序列的注释，利用DNASTAR软件对序列对获得的二十个棉种的trnT-trnL和trnH-psbA序列两端非目的核苷酸序列进行删除，利用ClustalX和BioEdit软件进行序列比对和人工校正，构建棉属DNA条形码（图1），为待测未知棉种的确定提供序列标准，直接通过显著的标记进行快速鉴定。为更清晰地展示序列信息，作为比对第一位的G₂的trnT-trnL核苷酸序列为：

TCAAATAATAGAAATTTTGTATCCATAGGGATTCAGCAAACTATTAGGATCTTATCTATTAACTATCTATTAGTTATTCATAATTAATATGAATTATTAATATGAATTATAGACTCGAATTTAGAAAAACTAGAATTTTTTCTAATTTTTAACGCCATACTTAATATAAATATATAAATATAACATATTTAATATAATAATGGTAGATTCAATCTAATATTCAAGCTAATGTTGATAGAATCTAATAATTAAGAATATAATAATTCTATTTTAATTTTATATATATATTTATTATTTATCTATATATTTAAGATCTTTTTTTATATCTTAGTTAGATTTCTTTTATATTAATATAGTAATATTACTAATATTACTGACTCAATTTTTATTTTAGAGTTTATTTTATATTTTAGATTTTAGTATATTTTACATCTAAATTATATAGAAAATTTTTTATATAGATTTCATTTAATCGATCGATTTAATAGATTTAATATAGATTAAATTTTTTTCTATTTAGTTTAGAGTTCTAAATAGAGATAATTAGAGTCAAAATCTTTTTATGCATTTATATATTTTATGATTATATAAATGAAATGATACGTTATAAGTCTAGATAATTAGAATGAAACTCTTTTTAGACTCAAAAATTTGAATTATCTTCGAATTCGAAATAGAAATGAATGGAATAATTAGTTCTAGCTATTATACTATAAAAAAATAATTAATTTAATTTTTATTTTTAATAATGAATAAATTAAATTTTAATTTTTTTTTTTTAGTTATCTTATTCTTATTATGGTTATATAGGATAGTCTAATAAAAGGATAAGAATAAAAATTAAATTAAAGAAAAAAAGATGCAACCCATAGAAATGAAATCCAGATCATAATGAGAGACTCCTTTCTTTTGTTTTCATTCATAAAGACAGAAGCTAAGACGAAAAAAAGAATCGACCGTTCGAGTATTCCACCAAATTGCCTGAGAAAACTGAGAGTAAGAGGGACATATATATGTTATGGAATACCCATCTATATTGAATTGCGAATACAGAAATGATAAAATATTTTCTGATTGGACCAAATAAAAATTAATATGGGTCTCCGATAGAGACGAAAGACGATAAACAAACAAGAAAATAGGTAAAGACCCTTCGATATAAGAATCTGTATCTATATCTACTAAATTCAACGGTTTCGCATAAAAAGAAAGCAAATAAATAAACGAAAGAAAATAAACAAATGAAAGAAGGGGTAAAGGGGGGGGGGAAAGGAGGGAGAAAGGGGGAAGGAGGGACATCCTAATGAGATCCTAATCTCAATACACAAAAGAAA

作为比对第一位的(AD)1的trnH-psbA核苷酸序列为：

CCCCTACAATTACTATACTCTATAGTATTTTTTTTACTTGTTTAAATATTTCAAATACAAATTGCAACGATTTCTATCAGTCATCATTCTTTTTTTTATCTTATTTCTGAGATCCAATATATAGAAAATTCCAATCTATATCTTTTATTTTTACCCTAAAATAAAAACTTTACAAAAGTTTGGTAAGAGCTTTTTTACTTATTTTTTATATTTTATATAAAATATAAAAAAAAGGTAAAGAAAAGAAAGACCACTAAATCGAAATAAAGGAGCAATACCAACACTCTTGCTAGAACAAGAAAGTGGTTATTGCTCCTTTATTTTCAAAAACTCGTATACACTAAAACCAAAGTC

实施例2 未知棉种的DNA条形码鉴定技术

1材料和方法

1.1实验材料

实验材料是九个不同棉种的叶片，分别编号1-9，来自于中国农业科学院棉花研究所。

1.2总DNA的提取

利用CTAB法对九个棉种总DNA进行提取。纯化后的DNA用紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量。DNA浓度稀释至60ng/μl左右，保存于4℃冰箱作为工作液使用。

1.3PCR扩增

设计降落PCR，利用通用引物进行扩增：所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。

50μl PCR反应体系：10×PCR缓冲液5.0μl，dNTPs5.0μl，MgSO₄2.0μl，总DNA2.0μl，引物F1.5μl，引物R1.5μl，KOD酶1.0μl，ddH2O32μl，混匀。然后94℃预变性5min；进行94℃30s、61℃退火30s（每次退火温度降1℃，共降6次）、68℃延伸2min（循环29圈）；最后68℃延伸5min，4℃保温。

1.4PCR产物检测及克隆测序

PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

载体连接转入感受态大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，将含有目的片段的菌液送上海生工生物工程股份有限公司，使用ABI仪进行测序。为保证测序的准确性，采用正反双向测序，且每个片段送三个样品作为重复。

1.5序列比对

三个重复序列比对，保证序列准确性。将序列与DNA条形码（图1）进行比对，序列完全一致的即为所指棉种。

2试验结果

2.1PCR扩增得出一致的电泳图，如图3，trnT-trnL序列泳道均位于1500bp左右，如图4，trnH-psbA序列泳道均位于400bp左右。

2.2将9个不同棉种得到的序列与DNA条形码（图1）进行比对，序列完全一致的即为所指棉种，结果1-9材料分别为陆地棉(AD)₁、海岛棉(AD)₂、草棉A₁、瑟伯氏棉D₁、长萼棉F₁、异常棉B₁、司笃克氏棉E₁、斯特体棉C₁和比克氏棉G₁。

Claims (4)

1.棉花叶绿体基因组中的转运RNA T和L的基因间区trnT-trnL以及转运RNAH和编码D1蛋白质的psbA基因的基因间区trnH-psbA的序列组合trnT-trnL+trnH-psbA作为棉属DNA条形码。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物对扩增棉花DNA，其中，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用引物对扩增棉花DNA，其中，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。

4.一种鉴定棉种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）设计通用引物，对已有棉种进行有效扩增，所述通用引物对包括TL和HA，对于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列为：CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列为：GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，对于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列为：CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列为：GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA；

2）提取目的棉种的棉花总DNA；

3）PCR扩增，利用步骤1）的通用引物对目的棉种的棉花总DNA进行降落PCR扩增；

4）PCR产物检测及克隆测序；

5）序列比对，参照条形码序列，去除测得序列的两端非目的片段序列，与DNA条形码进行比对，以确定棉种。

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