CN105154539B - 陆地棉特异性pcr引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法 - Google Patents

陆地棉特异性pcr引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供陆地棉特异性PCR引物对，其是根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列(HQ901197.1)设计的一对特异性引物，该引物对特异性强，仅对陆地棉具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。本发明还提供利用该引物对检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法。采用本发明提供的方法和引物检测陆地棉，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4.21E+04。利用该引物对检测植食性昆虫，可以辨别昆虫是否对棉花进行了取食。本发明采用PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。

Description

陆地棉特异性PCR引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及陆地棉特异性PCR引物对及其在植食性昆虫体内的检测方法。
背景技术
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，属锦葵科，一年生草本，是一种用途很广的天然纺织纤维，是我国重要的经济作物。
我国每年因棉花遭受虫害损失严重，而昆虫与植物间的关系一直是研究的热点。昆虫对植物的取食以及昆虫在植物间的转移扩散方面的研究，传统方法还是通过昆虫种群数量的变化动态来间接反映，或通过解剖观察法，标记法等。但是这些方法都存在费时，费力，花费较高，不易成功等缺陷。
PCR检测技术是通过特异序列扩增靶区域DNA，利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为昆虫对植物的取食的定性与定量以及昆虫在植物间的转移扩散分析提供了有效的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供陆地棉特异性PCR引物对。
本发明的另一目的是提供检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的陆地棉特异性PCR引物对是根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列(HQ901197.1)设计的，所述引物对包括：
正向引物MraF1：5'-CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3’(Seq ID No.1)
反向引物MraR1：5'-GCGACCATACTTGTTCAA-3’(Seq ID No.2)
本发明还提供含有所述引物对的用于PCR检测陆地棉的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括2×PCR MasterMix。2×PCR MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司(Tiangen公司)，货号CW2347。
更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供所述引物对或所述试剂盒在检测陆地棉中的应用。
所述应用包括以下步骤：1)提取待测样品DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用引物MraF1和MraR1进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
本发明进一步提供检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法，包括以下步骤：1)用CTAB法提取待测昆虫总DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用引物MraF1和MraR1进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。
其中，PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；72℃5分钟。
步骤3)中采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，陆地棉的扩增产物大小为247bp。
本发明根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列(HQ901197.1)设计一对特异性引物，该引物特异性强，仅对陆地棉具有扩增能力，而对同域的其他物种无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测陆地棉，准确性高，操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为4.21E+04。通过对取食过陆地棉的绿盲蝽DNA进行扩增，检测率达到100％，证明了该方法的可行性。
附图说明
图1为本发明实施例1中陆地棉特异性引物MraF1/MraR1的PCR检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-94为表1，表2中序号所对应物种的扩增结果，-为阴性对照。
图2为本发明实施例2中陆地棉特异性引物MraF1/MraR1的质粒浓度梯度检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-10为模板质粒浓度4.21E+10依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
图3为发明实施例3中陆地棉特异性引物MraF1/MraR1对取食了陆地棉的绿盲蝽DNA的检测结果；其中，M：DNA分子量标准2000bp ladder；1-10为绿盲蝽的扩增结果；+为陆地棉DNA的检测结果，-为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1特异性引物MraF1/MraR1对陆地棉的扩增效果
1、陆地棉基因组DNA的制备
将棉花叶片放入研钵中将其磨碎，用DNA quick Plant System快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型)(Tiangen公司)提取陆地棉基因组。将DNA溶液储于-20℃备用，进行PCR扩增时吸取1μL溶液作为DNA模板。
2、合成检测陆地棉的特异性引物
根据GenBank中公布的陆地棉rbcL序列(HQ901197.1)设计如下特异性PCR引物对：
MraF1：5'-CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3’(Seq ID No.1)
MraR1：5'-GCGACCATACTTGTTCAA-3’(Seq ID No.2)
3、PCR扩增
反应体系20μL：
PCR扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；最后72℃延伸5分钟。
4、PCR产物鉴定
取6μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
5、结果
利用引物MraF1/MraR1，以陆地棉DNA为模板，以陆地棉同域的46种其他物种(见表1、表2)为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，1、2泳道对应的陆地棉扩增出了247bp的目的条带，说明根据陆地棉的rbcL序列设计的PCR扩增引物特异性强。回收上述247bp的目的条带，进行测序，结果如Seq ID No.3所示。
表1 引物特异性检测中所涉及的植物种类
表2 引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
实施例2引物MraF1/MraR1对陆地棉最低检出量的测定
1、陆地棉模板基因组的制备，参照实施例1中步骤1操作。
2)陆地棉质粒的制备
按照实施例1中步骤3的方法对陆地棉基因组DNA进行扩增，扩增完毕后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pEasy-T3载体上(按试剂盒说明操作)，重组质粒转化Trans1-T1感受态细胞，然后涂布于含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。经蓝白斑筛选后，挑取10个阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中培养过夜，次日用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，所得质粒按10倍浓度进行梯度稀释，直至检测不出条带，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中，反应体系同实施例1中步骤3的描述。
利用引物MraF1/MraR1进行最低检出量的测定，以不同稀释倍数的陆地棉质粒浓度进行PCR扩增，模板质粒浓度检出限(拷贝数)为4.21E+04(图2)。
实施例3利用引物MraF1/MraR1对昆虫体内微量的陆地棉进行检测
1、将10头绿盲蝽饥饿处理24小时，用陆地棉叶子饲喂3小时后，立即用液氮冷冻处死。
/2、将单头绿盲蝽放在1.5ml的离心管中研碎，用CTAB法提取DNA。
在离心管中加入40μL的PBS(150mM NaCl,150mM NA3PO4,pH7.2，)，随后加入450μL的TES缓冲液(0.1M Tris，pH8，10mM EDTA,2％SDS)、10μL的蛋白酶K(10mg/ml)和10mg的PVP，在金属浴58℃放置12h。从金属浴中取出后加入150μL的5M NaCl和65μL的10％CTAB，将样品在金属浴65℃放置10分钟，取出后加入氯仿/异戊醇(24：1)进行抽提，静置后加入225μL的5M NH4Ac，冰上放置30分钟以上，取出后12000g离心20分钟，弃上清。向沉淀中加入异丙醇，沉淀过夜。12000g离心20分钟，弃上清，沉淀用70％的酒精洗涤，晾干后，加入100μL的ddH2O溶解DNA。
3、采用MraF1/MraR1按实施例1中步骤3的方法对绿盲蝽DNA进行PCR扩增，10头绿盲蝽均检测到取食了陆地棉(图3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.检测植食性昆虫体内微量陆地棉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用CTAB法提取待测昆虫总DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用引物MraF1和MraR1进行PCR扩增反应；
3)分析PCR产物；
其中，PCR反应体系以20μL计为：
PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，共40个循环；72℃5分钟；
所述引物MraF1和MraR1如下：
正向引物MraF1：5'-CGACATTGAGCCCGTTCCTG-3’
反向引物MraR1：5'-GCGACCATACTTGTTCAA-3’；
其中，所述植食性昆虫包括棉蚜、烟粉虱、苜蓿盲蝽、绿盲蝽、三点盲蝽、中黑盲蝽、大草蛉、中华草蛉、双代盲蝽茧蜂、棉蚜茧蜂、七星瓢虫、异色瓢虫、龟纹瓢虫、棉铃虫。
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