CN108950040A - 一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的its序列、特异性引物对、鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的its序列、特异性引物对、鉴定试剂盒及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。本发明所述ITS序列具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，可用于鉴定铁皮石斛与其高度相似的伪品。同时提供了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的试剂盒。进一步建立了相关的PCR检测体系，为铁皮石斛药材鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种相似度较高的石斛药材中快速、准确地检测区分出铁皮石斛，该方法操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对铁皮石斛药材的检测，适于广泛的推广使用。

Description

一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物 对、鉴定试剂盒及鉴定方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及铁皮石斛的分子生物学检测，尤其是一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。
背景技术
石斛是我国名贵的中药材，始载于《神农本草经》，列为上品，性甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效。在《中国药典》2015年版一部收载的石斛和铁皮石斛为两种不同药材品种。其中，石斛为金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)、鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl.)、流苏石斛(Dendrobiumfimbriatum Hook.)的栽培品种及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。而另外一种石斛品种，铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛(Dendrobiumofficinale Kimura et Migo)。
由于铁皮石斛具有全面的滋阴补益作用和广泛的保健功效，铁皮石斛一直被视为石斛中的珍品，因此，2010年版及2015年版《中国药典》将铁皮石斛单列而区别于金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛。铁皮石斛含有的多糖、氨基酸、微量元素、菲类、联苄类、酚酸类和生物碱等类型的化学成分。现代药理研究表明，铁皮石斛增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用。
我国铁皮石斛的种植规模快速发展，成为所有药用石斛中种植面积最大的品种。据统计铁皮石斛种植面积已达5万多亩，主要分布在云南、浙江、广东和广西等地。但石斛属种类繁多，仅供药用的石斛属植物就有39种。而且遍布各地有很多的习用品以及混伪品，如金石斛属、石豆兰属、石仙桃属等多个种。由于石斛的近似种以及混伪品过多，特别是名贵药材铁皮石斛的伪品，需要针对石斛的基源和药材进行过深入的研究，鉴定铁皮石斛及其伪品。
传统的鉴定方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。铁皮石斛与石斛属内其它品种性状相似，形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学的研究深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、ISSR标记、AFLP技术等得到了广泛的应用，但它们也存在很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的揭示亲缘物种间的演化关系，但不稳定，受实验条件限制较大；ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合，但其稳定性较差，且对操作者要求高、花费大。
ITS2是近年来用于探讨植物种内、种间变异及近缘属间变异重要的分子标记技术之一。通过ITS2序列对比，已经可以将于铁皮石斛与其他混淆品种进行一个大概的区分。但还有众多与铁皮石斛类似的品种具有与铁皮石斛高度相似的ITS2基因序列，因此无法准确区分铁皮石斛与其伪品。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。本发明所述特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法能够实现对铁皮石斛与其伪品的快速、准确鉴定。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明采集市场上真伪铁皮石斛品种，建立多批次品种积累ITS2序列数据库，通过比较各品种ITS2序列，分析铁皮石斛真品ITS2序列与其伪品之间的差异确定一个鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS2序列片段，长度为136bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体序列为：5’GCTCCGTGCCTTGTCATCAATTTATGGAAGTGTTGGTGAAGGCTCGGATGTGCATGGTGGCTCGTCGTGCTCCTCGGCACGGCGGGCTGAAGAGCGGGGCATCATCTCGTTGGCTGCGTACAATAAGTGGTGGAT3’。
通过比较分析各品种中是否包含如SEQ ID NO:1所示ITS序列可以确定其是否为铁皮石斛正品。因此本发明提供了如SEQ ID NO:1所示ITS序列在鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品中的应用。
本发明针对上述ITS序列提供了特异性引物对用于对铁皮石斛与其高度相似伪品进行鉴定。
在一些实施方案中，本发明提供了特异性引物对，其包括上游引物F：5'GCTCCGTGCCTTGTCATC3'(SEQ ID NO:2)和下游引物R：5'ATCCACCACTTATTGTACG 3'(SEQ IDNO:3)。
本发明还提供了一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的试剂盒，包括扩增所述的ITS序列的特异性引物。
在一些实施方案中，扩增所述的ITS序列的特异性引物具有如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明所述的该试剂盒中还包括PCR试剂。
所述PCR试剂包括但不限于dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、扩增缓冲液(PCR buffer)中至少一种。
在一些实施例中，所述PCR试剂包括dNTP与PCR buffer混合液。
在一些实施方案中，本发明所述的试剂盒中还包括电泳试剂。如琼脂和/或染料等。
所述染料可以为本领域内电泳常用的染料，包括但不限于溴酚蓝和二甲苯青。
本领域技术人员可以理解，本发明所述的试剂盒中还可以包括DNA分子量标准物。所述DNA分子标准物可以为AL2000 DNA Marker、AL5000 DNA Marker、DNA Marker II、50bpDNA Ladder marker、100bp DNA Ladder marker等。
在一些实施方案中，本发明所述的试剂盒中还包括本发明提供的试剂盒中还包括PCR反应管。
本发明还提供了一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的方法，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，以扩增所述的ITS序列的特异性引物进行PCR扩增，电泳检测PCR产物。
扩增反应结束后，若电泳检测结果出现约136bp的ITS序列的DNA条带，则该样品含有铁皮石斛。
在一些实施方案中，所述鉴定方法中，所述扩增所述的ITS序列的特异性引物具有如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列。
优选的，所述鉴定方法中，所述PCR扩增的反应体系以50μL计为：
优选的，所述鉴定方法中，所述PCR扩增的反应条件为：
对检测结果的判定可通过对扩增产物的电泳进行，也可通过对扩增产物的测序进行。为了缩短鉴定时间，结果的判定采用电泳的方式。优选的，所述电泳为琼脂糖凝胶电泳。
由上述技术方案可知，本发明提供了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂盒以及鉴定方法。本发明所述ITS序列具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，可用于鉴定铁皮石斛与其高度相似的伪品。同时提供了鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的试剂盒。进一步建立了相关的PCR检测体系，为铁皮石斛药材鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种相似度较高的石斛药材中快速、准确地检测区分出铁皮石斛，该方法操作简便，特异性好，灵敏度高，可实现对铁皮石斛药材的检测，适于广泛的推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1实施例2PCR扩增产物电泳图；其中，泳道1-9为分别对应样品#1-#9，DNAMarker为两则多个条带的泳道，用于指示DNA大小；
图2实施例2真伪铁皮石斛的ITS2序列对比，在DNA marker 100与200bp出现条带，说明样品能在特异性引物的条件下扩增出特定产物(136bp)，则为铁皮石斛正品，反之则为伪品；其中#1-#4为铁皮石斛伪品；#5-#9为铁皮石斛正品(通过中国科学院华南植物园华南植物鉴定中心鉴定#5-#9为铁皮石斛，其他为铁皮石斛伪品)。
具体实施方式
本发明公开了特异性引物PCR区分铁皮石斛和其伪品的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。
实施例1、用于检测铁皮石斛的PCR引物的合成
从GenBank中共获得铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛等石斛属ITS序列170条，利用生物学软件MEGA 5.0对比上述序列，找出铁皮石斛所有不同于其他种的变异位点。根据变异位点的位置，分别在ITS2序列的上、下游各设计约20个碱基的引物；利用生物学软件Primer Primier 5.0对设计的引物进行分析，最终确定合适的引物对：
上游引物F：5'GCTCCGTGCCTTGTCATC3'；和
下游引物R：5'ATCCACCACTTATTGTACG 3'。
实施例2、利用PCR引物检测市售的铁皮石斛样品
1、从市场上收集9种不同的铁皮石斛样品，每个样品取约30mg，加入灭菌小钢珠，用磨样机磨成粉末，利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。
2、使用ITS通用引物ITS 5F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS 4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分别进行PCR检测提取的各DNA样品的质量。
PCR反应体系：
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec，42℃1min，72℃1.22min，共40个循环；72℃7min。
设置空白对照，DNA模板用等量ddH2O代替，证明DNA的质量达到检测的要求，并确定了合适的DNA模板量为3μL。
3、利用实施例1设计的特异性引物F和R，对9个样品的总DNA进行PCR扩增：PCR反应体系和扩增条件如下：
PCR反应体系(50μL)：
PCR反应条件为94℃5min；94℃30sec，58℃1min，72℃1.22min，共40个循环；72℃7min。
4、取PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪上检测结果。结果如图1所示，9个样品中，泳道5-9出现约136bp的扩增条带，结果显示为阳性，其余结果呈阴性。表明#1-#4是市场购买的铁皮石斛伪品，而#5-#9泳道对应的样品为铁皮石斛。进一步对真伪铁皮石斛的ITS2序列进行比对，结果见图2。
SEQUENCE LISTING
<110> 无限极（中国）有限公司
<120> 一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的ITS序列、特异性引物对、鉴定试剂
盒及鉴定方法
<130> MP1704914
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 135
<212> DNA
<213> 铁皮石斛
<400> 1
gctccgtgcc ttgtcatcaa tttatggaag tgttggtgaa ggctcggatg tgcatggtgg 60
ctcgtcgtgc tcctcggcac ggcgggctga agagcggggc atcatctcgt tggctgcgta 120
caataagtgg tggat 135
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物F
<400> 2
gctccgtgcc ttgtcatc 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atccaccact tattgtacg 19

Claims (10)

1.如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的ITS序列。
2.权利要求1所述的ITS序列在鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品中的应用。
3.如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列的引物对。
4.扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物在鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物具有如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列。
6.一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的试剂盒，其特征在于，包括扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物具有如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR试剂和/或电泳试剂。
9.一种鉴定铁皮石斛与其高度相似伪品的方法，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，以扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物进行PCR扩增，电泳检测PCR产物。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增权利要求1所述的ITS序列的特异性引物具有如SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列；
所述PCR扩增的反应体系以50μL计为：
所述PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃30sec，58℃1min，72℃1.22min，共40个循环；72℃8min。
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