CN113652496A

CN113652496A - 鉴别石仙桃的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN113652496A
Application number: CN202110976314.5A
Authority: CN
Inventors: 梅志强; 王恺; 付俊江; 李春红
Original assignee: Southwest Medical University
Current assignee: Southwest Medical University
Priority date: 2021-08-24
Filing date: 2021-08-24
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2041-08-24
Also published as: CN113652496B

Abstract

本发明公开了一种鉴别石仙桃的试剂盒和方法，属于基因检测领域。该试剂盒包括检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂。本发明首次发现SEQ IDNO.1所示核苷酸序列为石仙桃特异性序列，通过检测这个序列可以准确鉴定待检样本是否为石仙桃，区分石仙桃与石斛以及其他品种的药物植物，为药材的合理使用提供指导。本发明提供的试剂盒可以准确、有效的鉴别石仙桃，特异性强。本发明提供的鉴别方法操作简便，耗时短，测试准确度高，具有良好的应用前景。

Description

鉴别石仙桃的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种鉴别石仙桃的试剂盒和方法。

背景技术

石斛(学名：Dendrobium nobile Lindl)，又名仙斛兰韵、不死草、还魂草、紫萦仙株、吊兰等。茎直立，肉质状肥厚，稍扁的圆柱形，长10～60厘米，粗达1.3厘米。药用植物，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。石斛为较常用中药。始载于《神农本草经》，列为上品。本品其性味甘，微寒。归胃，肾经。具有益胃生津，滋阴清热的功能，主治阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。根据(2000)年版药典中所记载石斛的品种包含铜皮石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、铁皮石斛、金钗石斛等。

因近年石斛药用、保健用量增加，市场价格一路攀升，导致不法药商以伪充真。中药市场药检发现有人把兰科植物石仙桃(Pholidota chinensis Lindl.)的假鳞茎洗净切段，并在外表染上黄绿色，混充石斛入药，使得饮片性状与正品混淆，无法区分。石仙桃和石斛均属于兰科，都是多年常绿附生草本植物，石仙桃为兰科植物石仙桃属植物石仙桃的干燥根茎。石仙桃具有养阴、清肺、利湿、消瘀的功效，用于眩晕、头痛、咳嗽、吐血、梦遗、痢疾、白带、疳积，其与石斛功效有差异，两者不能混用。

目前鉴别石仙桃的方法多为肉眼观察或者生化试剂鉴定，但准确率难以保证。因此，开发出一种能够方便、快速、准确的鉴别出石仙桃的方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方便、快速、准确的鉴别石仙桃的试剂盒和方法。

本发明提供了一种鉴别石仙桃的试剂盒，所述试剂盒包括检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂。

进一步地，所述检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对。

进一步地，所述扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的PCR引物对。

本发明还提供了一对用于检测石仙桃基因的引物对，所述引物对能够扩增SEQ IDNO.1所示的序列。

进一步地，所述引物对为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的PCR引物对。

本发明还提供了一种鉴别石仙桃的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本的DNA；

(2)检测待检样本的DNA中是否含有SEQ ID NO.1所示序列，如果含有则判断待检样本是石仙桃，否则判断待检样本不是石仙桃。

进一步地，步骤(2)为：利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的PCR引物对扩增待检样本的DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO.1所示序列则判断待检样本是石仙桃，如果不能够扩增出SEQ ID NO.1所示序列则判断待检样本不是石仙桃。

本发明还提供了上述试剂盒在鉴别石仙桃中的用途。

本发明还提供了上述引物对在鉴别石仙桃中的用途。

本发明首次发现SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为石仙桃特异性序列，通过检测这个序列可以准确鉴定待检样本是否为石仙桃，区分石仙桃与石斛以及其他品种的药物植物，为药材的合理使用提供指导。

本发明提供的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的PCR引物对可以特异性、有效的扩增石仙桃的基因，能够用于准确鉴别石仙桃。

本发明提供的试剂盒可以准确、有效的鉴别石仙桃，特异性强。本发明提供的鉴别方法操作简便，耗时短，测试准确度高，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.石仙桃的改良RAPD扩增。箭头为M19-45的RPAD片段，用于胶回收和克隆；1-10号通道分别代表蜂腰石斛，球花石斛、长苏石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、石仙桃、铜皮石斛、翅梗石斛、铁皮石斛、金钗石斛；通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000 DNA标记。

图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。箭头所指通道的阳性克隆用于Sanger测序；通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000 DNA标记；1号通道代表A6-33重组质粒的阳性克隆菌落。

图3不同石斛品种的鉴定。1-20号通道分别代表蜂腰石斛、球花石斛、长苏石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、石仙桃、铜皮石斛、翅梗石斛、铁皮石斛、金钗石斛、枸杞、荔枝、银杏、金银花、薄荷、赶黄草、当归、桂圆、栀子、赤灵芝；通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000 DNA标记。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明实施例采用的石仙桃(Pholidota chinensis Lindl.)来自广西百色市。

实施例1 RAPD技术扩增石仙桃特异SCAR标记

一、CTAB法提取植物DNA

取石斛样本或石仙桃样本0.2g置于1.5mL EP管中，加入液氮半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μL的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol^.L^-1，EDTA20mmol mmol^.L^-1，NaCl 1.4mol^.L^-1，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μL的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μL，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。本实验提取了10个样本DNA，分别是蜂腰石斛、球花石斛、长苏石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、石仙桃、铜皮石斛、翅梗石斛、铁皮石斛和金钗石斛样本。

二、RAPD技术PCR扩增

利用RAPD技术进行扩增(参照Fu J,Yang L,Khan MA,Mei Z(2013)Geneticcharacterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by usingimproved RAPD analysis.Mol Biol Rep,40(10):5993-9)：

以步骤一提取的样本DNA作为模板，用RAPD引物SBS-A6进行扩增(序列见表1，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μL反应体系包括：1μL的引物(2.5μmol/L),1.5μL(15ng)模板DNA，5μL的2×PCR Taq Mastermix(天根生物公司，北京)和2.5μL的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems

96-WellThermal Cycler，Life Technology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

表1 RAPD引物SBS-A6的序列

Primer	Sequence5’-3’
		SBS-A6	GGTCCCTGAC(SEQ ID NO.2)

琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。

(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压120V，电泳时间30min即可。

三、RAPD扩增条带的分离

1.片段回收

1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图1石仙桃品种的特异片段A6-33，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。

2.克隆

接着利用pGEM-T载体(Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(4℃连接12小时)。连接后加入30μL活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μL无氨苄青霉素的LB培养基(配制方法：12.5克LB粉加500mL水高温灭菌)200转每分钟摇动45分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37℃培养15小时[固体培养基配制方法：12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500μL的氨苄青霉素(100mg/mL)，使用前在固体培养基表面涂抹40μL的20mg/mL的X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20μL的24mg/mL的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)]进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。

3.阳性克隆鉴定

每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300μL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，220转每分钟摇2-4小时，取0.2～0.5μL培养基进行菌落PCR反应。10μL体积的反应体系是：2×PCR Taq Mastermix 5μL，DNA 0.5μL，通用引物1μL(2.5μmol/L)，水3.5μL。

通用引物序列为：SP6:ATTTAGGTGACACTATAGAA(SEQ ID NO.3)+T7:TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.4)。

PCR反应条件是：95℃1分30秒，94℃40秒，58℃30秒，72℃40秒，30个循环，最后72℃5分钟。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色、曝光显色。

4.结果

改良RAPD扩增见图1。阳性克隆的菌落PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。可以看出，菌落PCR得到的片段大小和图切下来被克隆的片段大小一致，初步说明得到了阳性克隆菌落。

四、测序分析

挑选阳性克隆，进行Sanger测序。测序的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1所示)。

SEQ ID NO.1(583bp)：

GGTCCCTGACACGAACAGGTCACCCTGCAACCTCGCATCATTCTGCACCATTGCTCATGGTCATGCCACACGCCGCTCACCGCTCTGATGCACCGCCATTAATCATGCAACCCAGTGCCATTCGACCCCCCTCTCCTCACTAAATTATGACACATTGGGGTCGTAATAGGTGTCGTGAGCCCTCCCCACTCCCCTTCTTTCGCTCCCATCATTAGAACCAGTCCCACCGCCCGCTATCATCCTTCCATCACTGGCCACCGCACAACAGCTCCAGCTCGCCACCTACGCACAGTGCCAACACCTCGCCCTCTTCCTCTCTCCCTCTCTACCATTGGCGAGATCCACCGACTGCCCTTCCAACATGGTGACTTTGTTGCCATTATTTGATGGCATCGTTGCCTTCTATTAACACTATCACCATTACGTCATCACCTCTGTTGGCGACCACCGCTATCATCATTGCCACTTTCATTGACAACCATCACTGCCACCATCGTTGTCTCCATTGGCGATCATTACTGCCACCGTTGCTGCCTCTATTGGCGACCTCCACTAGTGCTATCACTACCTCTGTCAGGGACCA。

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列是石仙桃特有的核苷酸序列，可用于建立石仙桃特异的SCAR标记。

实施例2用本发明方法特异扩增石仙桃的基因

一、实验方法

(一)根据实施例1得到的石仙桃特异的SCAR标记(SEQ ID NO.1所示的序列)，设计合成表2所示的一对引物。

表2 SCAR序列，PCR条件和产物大小

(二)PCR扩增

1、模板制备

检测不同物种：选取20个不同地区石斛、石仙桃或者其他药用植物基因组DNA作为模板，1-20号通道分别代表蜂腰石斛、球花石斛、长苏石斛、黑毛石斛、玫瑰石斛、石仙桃、铜皮石斛、翅梗石斛、铁皮石斛、金钗石斛、枸杞、荔枝、银杏、金银花、薄荷、赶黄草、当归、桂圆、栀子、赤灵芝。分别稀释成10ng/μL备用。

基因提取方法同实施例1。

2、PCR扩增：

(1)PCR体系(10μL)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems

96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR扩增条件

3、琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)

(1)脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.6g琼脂粉，加入1×TAE 40mL，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入Goldview 1μL，混匀，待冷却至50℃备用；

(2)用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

(3)点样：

(4)130V电泳35min；

4、图像摄取：(BIO-RAD，Universal HoodⅡ)

二、实验结果

如图3所示，本发明设计的引物可以从石仙桃中扩增出特异性基因片段，而其他品种的石斛没有扩增出特异性条带，其他品种植物基因组也没有扩增出任何条带。

实验结果说明，本发明提供的引物对的特异性良好，可以特异、有效扩增石仙桃的基因，能够用于有效鉴别石仙桃样本。

实施例3本发明石仙桃检测试剂盒和使用方法

一、试剂盒组成

本试剂盒含有：

CTAB提取缓冲液(200mL)；

2×Taq Master Mix，其中，引物为表2中A6-33所示引物对(即SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的引物对；500μL)；

阴性对照模板DNA(铁皮石斛或金钗石斛的DNA)一管(50μL)；

阳性对照模板DNA(石仙桃DNA)一管(50μL)；

灭菌ddH₂O(1500μL)。

(一)CTAB提取缓冲液配方

CTAB提取缓冲液(100mL)配方如下：

用HCl调至pH 5.0，加H₂O至100mL。

(二)PCR体系2×Taq Master Mix的配方

2×Taq Master Mix(500μL)配方如下：

二、检测方法

(一)PCR扩增

1、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。

2、进行PCR扩增：

具体如下：

充分混匀后，12000rpm离心30s；

注：2×Taq Master Mix，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照。

3、放入PCR仪上(Mastercycler 5331PCR仪器，德国Eppendorf，或者其它PCR仪器如Applied Biosystems

96-Well Thermal Cycler)，采用如下程序。

(二)琼脂糖凝胶电泳：

1、琼脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.6g琼脂粉，加入1×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入Goldview 1μL，混匀，待冷却至50℃备用；

2、用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：注意加样顺序，并加上DNA的分子Marker

4、130V电泳35min；

(三)结果检测与分析

在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以有效鉴定石仙桃，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南医科大学

<120> 鉴别石仙桃的试剂盒和方法

<130> GY185-2021P0113687CC

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 583

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtccctgac acgaacaggt caccctgcaa cctcgcatca ttctgcacca ttgctcatgg 60

tcatgccaca cgccgctcac cgctctgatg caccgccatt aatcatgcaa cccagtgcca 120

ttcgaccccc ctctcctcac taaattatga cacattgggg tcgtaatagg tgtcgtgagc 180

cctccccact ccccttcttt cgctcccatc attagaacca gtcccaccgc ccgctatcat 240

ccttccatca ctggccaccg cacaacagct ccagctcgcc acctacgcac agtgccaaca 300

cctcgccctc ttcctctctc cctctctacc attggcgaga tccaccgact gcccttccaa 360

catggtgact ttgttgccat tatttgatgg catcgttgcc ttctattaac actatcacca 420

ttacgtcatc acctctgttg gcgaccaccg ctatcatcat tgccactttc attgacaacc 480

atcactgcca ccatcgttgt ctccattggc gatcattact gccaccgttg ctgcctctat 540

tggcgacctc cactagtgct atcactacct ctgtcaggga cca 583

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtccctgac 10

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atttaggtga cactatagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taatacgact cactataggg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcaacggtg gcagtaatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccctctcta ccattggcga 20

Claims

1.一种鉴别石仙桃的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增SEQ ID NO.1所示序列的引物对为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的PCR引物对。

4.一对用于检测石仙桃基因的引物对，其特征在于：所述引物对能够扩增SEQ ID NO.1所示的序列。

5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的PCR引物对。

6.一种鉴别石仙桃的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本的DNA；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(2)为：利用SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的PCR引物对扩增待检样本的DNA，如果能够扩增出SEQ ID NO.1所示序列则判断待检样本是石仙桃，如果不能够扩增出SEQ ID NO.1所示序列则判断待检样本不是石仙桃。

8.权利要求1～3任一项所述的试剂盒在鉴别石仙桃中的用途。

9.权利要求4～6任一项所述的引物对在鉴别石仙桃中的用途。