CN110066878B - 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法 - Google Patents

一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110066878B
CN110066878B CN201910212299.XA CN201910212299A CN110066878B CN 110066878 B CN110066878 B CN 110066878B CN 201910212299 A CN201910212299 A CN 201910212299A CN 110066878 B CN110066878 B CN 110066878B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
coi
earthworm
naoxintong
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910212299.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110066878A (zh
Inventor
苏薇薇
朱晓枭
吴灏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN201910212299.XA priority Critical patent/CN110066878B/zh
Publication of CN110066878A publication Critical patent/CN110066878A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110066878B publication Critical patent/CN110066878B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

发明公开了脑心通胶囊地龙药材的DNA分子鉴别方法。本方法采用蛋白酶K消化动物药组分，广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取胶囊中的植物药组分。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计3对地龙特异性引物进行PCR扩增；将产物电泳检测测序，所得序列在GenBank数据库中用BLAST进行判定，以相似性最高的序列对应物种为最接近物种。本发明的地龙特异性引物可扩增200‑350bp的小片段基因，不受地龙的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的优点。本方法可针对含地龙细粉的中药制剂进行地龙成分鉴定，填补了脑心通胶囊在地龙质量控制方面的空白，提高了该药的质量控制水平。

Description

一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法。
背景技术
脑心通胶囊为陕西步长制药有限公司独家单一品规的中药品种(国药准字Z20025001，规格：每粒装0.4g)，是由黄芪、丹参、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、醋乳香、醋没药、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、水蛭、全蝎等16味中药直接散粉制药而得，其功能主治益气活血，化瘀通络。用于气虚血滞、脉络痹阻所致中风，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短，脑梗塞、冠心病心绞痛的治疗。
地龙作为脑心通胶囊的臣药之一，功能主治清热定惊，通络，平喘，利尿。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少。据2015年版《中国药典》(一部)记载，地龙(Pheretima)来源为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”。
在我国，地龙的原动物蚯蚓品种繁多、形态相似，因此地龙药材品种来源复杂，市场上品种混杂和掺假现象也较为普遍，最常见的伪品有大腔蚓Metaphire magna(Chen)、暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus(Chen)等。地龙药材的传统鉴别主要以基原、性状、显微和薄层鉴别为主，专属性和特异性都不强，对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，一般人难以区分；同时传统方法也存在局限性，特别是药材加工切断或粉碎制成中药制剂后，性状特征消失，难以满足实际工作需求。就脑心通胶囊而言，目前尚未有研究报道该胶囊中地龙的有效鉴别方法，2015年版《中国药典》(一部)中也未对脑心通胶囊中地龙的质量控制进行规定。
因此，在尚不能明确其他蚯蚓物种能否应用于临床的情况下，急需建立准确、方便、通用的鉴定方法来确保地龙药材的正品基原，加强对脑心通胶囊的监管与质量控制，以保证临床用药安全。
随着分子生物学领域的迅速发展，DNA条形码分子鉴定技术应运而生，被广泛应用于市售中药材的鉴定。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，在动物类中药材中采用线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为主体序列，ITS2为辅助序列。近年来，国内许多研究者探讨了应用CO Ⅰ、12S rRNA、16S rRNA和Cyt b等基因序列对蚯蚓进行分类鉴别的可能性，结果表明CO Ⅰ、12SrRNA和16S rRNA基因可以在不同程度上有效鉴定蚯蚓种类，以判定地龙药材的正伪。
但上述研究多以CO Ⅰ、12S rRNA和16S rRNA基因的通用引物对药材DNA进行PCR，扩增的目的产物片段大小在350～700bp左右。然而，就脑心通胶囊而言，在地龙药材的制作(晒干)、加工(粉碎)和保存过程中不免发生DNA的降解，基因裂解为小片段，不能被上述通用引物扩增出来；此外，除地龙外，脑心通胶囊中还含有水蛭和全蝎两种动物药，也可以被上述通用引物扩增出与地龙相似大小的基因片段。因此，设计能扩增出小片段基因的地龙特异性引物，对于脑心通胶囊中地龙基原正品的鉴定显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对在中药制剂脑心通胶囊中地龙形态特征缺失，缺乏科学鉴定手段的现状，提供一种科学、准确、有效的分子生物学鉴定方法，该方法包括以下步骤：
1、脑心通制剂总DNA的提取：用蛋白酶K消化制剂中动物药组分，按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物药组分；得脑心通胶囊总DNA的提取物；
2、PCR扩增：反应体系为15μL，脑心通制剂总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl2溶液1.5μL，2.5mM dNTPs 1.2μL，地龙特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃或58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述地龙特异性引物包括3个引物对，序列如下：
COI Metaphire F2/R2：COI Metaphire F2：5’-TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT-3’，COIMetaphire R2：5’-CTACTGCCCACACAAATAGTGGG-3’，扩增片段长度为232bp；
COI AA F2/R1：COI AA F2：5’-CTTGGAAGAGATCAGCTATAC-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为337bp；
COI AA F3/R1：COI AA F3：5’-TTTGGAAACTGACTGCTCCCA-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为247bp。
3、电泳检测及测序：取步骤2所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，纯化测序；
4、鉴定：将步骤3中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。
所述蛋白酶K消化制剂中动物药组分的具体操作步骤可为：取脑心通制剂细粉，加缓冲液AP1和蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜。
优选地，所述步骤2中的10×PCR缓冲液包括以下组分：750mM Tris，pH值为8.8；200mM(NH4)2SO4；15mM MgCl2；0.1％(v/v)Tween 20。
优选地，所述步骤2中的3个引物对中，COI Metaphire F2/R2引物对是针对地龙的Metaphire属设计的特异性引物，该属对应2015年版《中国药典》(一部)中地龙药材收载的正品之二：通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen和威廉环毛蚓Pheretima guillelm(Michaelsen)；COI AA F2/R1和COI AA F3/R1引物对是针对地龙的Amynthas属设计的特异性引物，该属对应2015年版《中国药典》(一部)中地龙药材收载的正品之二：参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)和栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen。
优选地，所述步骤2中引物对对应的退火温度为：COI Metaphire F2/R2引物对，退火温度为58℃；COI AA F2/R1和COI AA F3/R1引物对，退火温度为55℃。
优选地，所述步骤3的具体方法为：取5μL步骤2所得的PCR产物与1μL 6×RNA/DNALoading buffer混合，于1.5％琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳20～30min后，置紫外灯下观察，得单一明亮条带，纯化后测序。
所述步骤(4)中：对于同一待鉴定样品，地龙正品同时满足以下2个条件：
(1)在电泳检测时，待鉴定样品的电泳检测条带与3个引物对中任意一对对应；
(2)测序后进行BLAST判定，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。
优选地，在使用引物之一COI Metaphire F2/R2进行检测时，步骤更为简单，当电泳检测步骤得到单一明亮条带即可判断该制剂含正品地龙通俗环毛蚓或威廉环毛蚓，从而省略余下步骤，使检测更方便快捷。
脑心通制剂优选脑心通胶囊，特别是由陕西步长制药有限公司生产的脑心通胶囊。
本发明所述的脑心通制剂是指以脑心通胶囊处方为基础，按中医理论加减所得处方而制成的任何适用于临床应用的剂型。
本发明方法可扩增地龙200～350bp的小片段基因，能针对经加工(切断)的地龙饮片及经粉碎制成的含地龙中药制剂，特别是脑心通制剂进行鉴定，不受地龙的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的特点。此外，本发明所设计的引物之一COI Metaphire F2/R2可以不用测序，仅根据琼脂糖凝胶电泳结果区分陕西步长制药有限公司所用投料药材沪地龙(通俗环毛蚓和威廉环毛蚓)和其它地龙类药材，可更为快速、经济地对该胶囊中的地龙药材进行鉴别。本发明在脑心通胶囊等脑心通制剂中的应用，填补了该胶囊在地龙的质量控制方面的空白，提高其质量控制水平。
附图说明
图1是引物COI Metaphire F2/R2对地龙药材进行PCR的产物电泳检测图。
图2是引物COI AA F2/R1对地龙药材进行PCR的产物电泳检测图。
图3是引物COI AA F3/R1对地龙药材进行PCR的产物电泳检测图。
图1～3中，“M”为DNA Marker(GeneRuler 100bp DNA Ladder)；“P1～P15”为15批地龙药材；“N”为空白对照。
图4是引物COI AA F2/R1和COI AA F3/R1所扩增的地龙药材序列对比图(图中AS为参环毛蚓Amynthas aspergillum)。图4由图4-1及图4-2组成。
图5是引物COI Metaphire F2/R2对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图(图中“M”为DNA Marker(GeneRuler 100bp DNA Ladder)；“N1～N9”为9批脑心通胶囊；“N”为空白对照；“T40”为缺地龙的脑心通胶囊阴性对照)
图6是引物COI AA F2/R1对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图。
图7是引物COI AA F3/R1对脑心通胶囊进行PCR的产物电泳检测图。
图6、图7中，“M”为DNA Marker(BM2000DNA Marker)；“N1～N9”为9批脑心通胶囊；“N”为空白对照；“P6”为参环毛蚓Amynthas aspergillum。
图8是引物COI Metaphire F2/R2所扩增的脑心通胶囊序列对比图(图中MV为通俗环毛蚓Metaphire vulgaris)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1单味地龙药材的DNA分子鉴别方法
1.实验样品
实施例中所用地龙实验样品如表1所示，表中各样品的鉴定是通过使用COⅠ通用引物LCO1490/HCO2198(LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)进行PCR扩增、测序后，进行BLAST，与待测序列相似性最高的序列对应的物种即为待测样品最接近的物种。其中P1～P4为陕西步长制药有限公司提供的地龙投料药材，经鉴定为通俗环毛蚓和威廉环毛蚓。
表1市售地龙商品来源表
Figure BDA0002000910510000051
Figure BDA0002000910510000061
2.待鉴别地龙的总DNA提取
取地龙药材20～50mg于灭菌后的1.5mL离心管中，用消毒后的小剪刀将地龙组织剪碎，使用组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒(Biomed,Beijing,China)提取总DNA，具体操作参见试剂盒说明书。按此方法提取获得15批地龙药材的总DNA，存于-20℃。
3.地龙特异性引物的设计
在NCBI(National Center for Biotechnology Information)的GenBank数据库中下载地龙正品所属的2个属(Metaphire属和Amynthas属)下各物种的COⅠ片段，其中Metaphire属共计60条，Amynthas属共计122条，登录号分别见表2、3。运用BioEdit v7.0.4软件对这些序列进行排序、比对、分析后，基于地龙正品与伪品之间的种间差异，分别设计了针对Metaphire属和Amynthas属的地龙特异性引物，其序列如表4所示。由北京六合华大基因科技有限公司(广州分公司)合成。
表2 GenBank中地龙Metaphire属下各物种的COI序列列表
Figure BDA0002000910510000062
Figure BDA0002000910510000071
表3 GenBank中地龙Amynthas属下各物种的COI序列列表
Figure BDA0002000910510000072
Figure BDA0002000910510000081
表4地龙Metaphire属和Amynthas属的特异性引物
Figure BDA0002000910510000082
4.PCR扩增
以待测样品的基因组DNA作为模板，采用步骤3设计合成的三对地龙特异性引物对按照如下分别进行PCR扩增：
反应体系为15μL，其中0.5μL待鉴定的DNA模板，1.5μL 10×PCR缓冲液(750mMTris(pH 8.8)，200mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2，0.1％(v/v)Tween 20)，1.5μL 25mM MgCl2溶液，1.2μL 2.5mM dNTPs(Biomed,Beijing,China)，10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；同时设置以ddH2O为模板作为阴性对照。PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃/58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min。其中，Metaphire属的引物对退火温度为58℃，Amynthas属的引物对退火温度为55℃。
5.琼脂糖凝胶检测与测序
以琼脂糖制备凝胶，并加入SYBRTM Safe DNA gel stain(ThermoFisherScientific,US)染色。取5μL步骤4所得的PCR产物与1μL 6×RNA/DNA Loading buffer(Biomed,Beijing,China)混合，于1.5％琼脂糖凝胶上进行点样，DNA Marker为GeneRuler100bp DNA Ladder(ThermoFisher Scientific,US)。120V条件下电泳20～30min后，置凝胶成像系统观察，结果如图1～3所示。得到的单一明亮条带，切胶后经多功能DNA纯化回收试剂盒(Biomed,Beijing,China)纯化后送北京六合华大基因科技有限公司(广州分公司)测序。
6.鉴定及结果
步骤5中测得的序列去除引物和低质量区域后，将获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。
结果显示，(1)引物COI Metaphire F2/R2可以特异性地扩增Metaphire属的地龙正品通俗环毛蚓和威廉环毛蚓的基因，而不能将Amynthas属的地龙正品以及伪品进行扩增；(2引物COI AA F2/R1、COI AA F3/R1可以扩增Amynthas属的地龙正品参环毛蚓及部分伪品的基因，须进行测序(图4)来区分正品参环毛蚓与伪品，且其不能将Metaphire属的地龙正品通俗环毛蚓和威廉环毛蚓进行扩增。
实施例2一种脑心通胶囊中地龙药材的DNA分子鉴别方法
1.实验样品
脑心通胶囊9批(批号：171275、171278、1712103、1712104、1712105、180478、180585、180655、180721)，均来自于陕西步长制药有限公司，依次编号NXT-1～9。
2.待鉴别脑心通胶囊的总DNA提取方法
采用广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(Biomed,Beijing,China)提取胶囊中的植物药组分，并在过程中加入蛋白酶K用来消化胶囊中的动物药组分。具体步骤为：取约50mg脑心通胶囊细粉到一个1.5mL灭菌离心管，加入400μL缓冲液AP1(该缓冲液由上述广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提供)和20μL蛋白酶K(20mg/mL,Biomed,China)，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜；接下来的步骤与试剂盒说明书步骤一致。
取9批脑心通胶囊及缺地龙的脑心通胶囊阴性对照(编号T4840)按上述方法提取总DNA，用超微量紫外/可见光分光光度计NanoDrop 2000c(Thermo Scientific,US)测得核酸浓度，保存于-20℃。
3.PCR扩增、产物检测与测序
将上述9批脑心通胶囊及缺地龙的脑心通胶囊阴性对照(编号T4840)的DNA稀释到浓度为49.50～50.50ng/μL，以此为DNA模板，根据实施例1所述地龙药材的DNA分子鉴别方法步骤4～5进行PCR扩增、产物琼脂糖凝胶检测、测序，以ddH2O为模板的作为空白对照。获得3对地龙特异性引物对9批脑心通胶囊进行扩增的产物琼脂糖凝胶图，如图5～7所示。
4.鉴定及结果
按实施例1步骤6所述方法对上述9批脑心通胶囊中是否存在地龙正品进行判定，得到地龙特异性引物对脑心通胶囊进行扩增的产物序列对比如图8所示。
从图5～8可知，仅引物对COI Metaphire F2/R2可以在9批脑心通胶囊中扩增出条带，且测序结果经BLAST后显示这9批胶囊中所含地龙与地龙正品通俗环毛蚓Pheretimavulgaris Chen(Metaphire vulgaris，GenBank登录号KJ137279.1)相似度达99％，可判定这9批胶囊中含有地龙正品通俗环毛蚓；而引物对COI AA F2/R1和COI AA F3/R1没有扩增出条带，说明这9批胶囊中不含Amynthas属的地龙正品。序列表中序列编号与序列名称对应如下表5所示：
表5
Figure BDA0002000910510000101
Figure BDA0002000910510000111
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种脑心通胶囊中地龙药材的DNA分子鉴别方法
<130> 2019
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttagtgtcgt ccgccgcagt t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctactgccca cacaaatagt ggg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttggaagag atcagctata c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaaaattga tgaggcaccc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaaaattga tgaggcaccc 20
<210> 6
<211> 337
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 6
cttggaagag atcagctata caacacaatt gtaacagcac acgcatttct aataattttc 60
tttctagtga tgccagtatt tattggaggt tttggaaact gactgctccc acttatacta 120
ggaacccccg acatagcatt cccacgtcta aataacataa gattttgact tttgccgcca 180
tccttaattc tattagtaag gtctgcggct gttgaaaagg gggctggtac cggatgaaca 240
gtttaccccc ctttagcaag aaacatagca catgcaggtc cctctgtaga ccttgcaatt 300
ttctcactac atttagcggg tgcctcatca attttag 337
<210> 7
<211> 337
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 7
cttggaagag atcagctata caacacaatt gtaacagcac acgcatttct aataattttc 60
tttctagtaa taccagtatt tattggtggt tttggaaact gactgctccc acttatacta 120
ggaacccccg atatagcatt cccacgtcta aataatataa gattttgact tttgccacct 180
tccttaattc tattagtaag gtctgcggct gttgaaaagg gggctggcac cggatgaaca 240
gtctaccccc ctttagcaag aaacatggca catgcaggtc cctctgtaga ccttgcaatt 300
ttctcactac atttagcggg tgcctcatca attttag 337
<210> 8
<211> 337
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 8
cttggaagag atcagctata caacacaatt gtaacagcac acgcatttct aataattttc 60
tttctagtaa tgccagtatt tattggcggg tttggaaact gactgctccc acttatacta 120
ggaacccccg acatagcatt cccacgtcta aataacataa gattttgact tttgccacca 180
tccttaattc tattagtaag gtctgcggct gttgaaaagg gagccggtac cggatggaca 240
gtttaccccc ctttagcaag aaacatagca catgcgggcc cctctgtaga ccttgcaatt 300
ttctcactac atttagcggg tgcctcatca attttag 337
<210> 9
<211> 337
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 9
cttggaagag atcagctata caacacaatt gtaacagcac acgcatttct aataattttc 60
tttctagtga tgcaagtatt tattggcggt tttggaaact gactgctccc acttatacta 120
ggaacccccg acatagcatt cccacgtcta aataacataa gattttgact tttgccgcca 180
tccttaattc tattagtaag gtctgcggct gttgaaaagg gggctggcac cggatgaaca 240
gtttaccccc ctttagcaag aaacatagca catgcgggtc cctctgtaga ccttgcaatt 300
ttctcactac atttagcggg tgcctcatca attttag 337
<210> 10
<211> 337
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 10
cttggaagag atcagctata caacacaatt gtaacagcac acgcatttct aataattttc 60
tttctagtaa tgccagtatt tattggtggg tttggaaact gactgctccc acttatacta 120
ggaacccccg acatagcatt cccacgtcta aataacataa gattttgact tttgccacca 180
tccttaattc tattagtaag gtctgcggct gttgaaaagg gagccggtac cggatggaca 240
gtttaccccc ctttagcaag aaacatagca catgcgggcc cctctgtaga ccttgcaatt 300
ttctcactac atttagcggg tgcctcatca attttag 337
<210> 11
<211> 296
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 11
aacacaattg taacagcaca cgcatttcta ataattttct ttctagtgat gccagtattt 60
attggaggtt ttggaaactg actgctccca cttatactag gaacccccga catagcattc 120
ccacgtctaa ataacataag attttgactt ttgccgccat ccttaattct attagtaagg 180
tctgcggctg ttgaaaaggg ggctggtacc ggatgaacag tttacccccc cttagcaaga 240
aacatagcac atgcaggtcc ctctgtagac cttgcaattt tctcactaca tttagc 296
<210> 12
<211> 296
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 12
aacacaattg taacagcaca cgcatttcta ataatcttct ttctagtgat gccagtattt 60
attggaggtt ttggaaactg actgctccca cttatactag gaacccccga catagcattc 120
ccacgtctaa ataacataag attttgactt ttgccgccat ccttaattct attagtaagg 180
tctgcggctg ttgaaaaggg ggctggtacc ggatgaacag tttacccccc tttagcaaga 240
aacatagcac atgcaggtcc ctctgtagac cttgcaattt tctcactaca tttagc 296
<210> 13
<211> 296
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 13
aacacaattg taacagcaca cgcatttcta ataattttct ttctagtaat gccagtattt 60
attggtgggt ttggaaactg actgctccca cttatactag gaacccccga catagcattc 120
ccacgtctaa ataacataag attttgactt ttgccaccat ccttaattct attagtaagg 180
tctgcggctg ttgaaaaggg agccggtacc ggatggacag tttacccccc tttagcaaga 240
aacatagcac atgcgggccc ctctgtagac cttgcaattt tctcactaca tttagc 296
<210> 14
<211> 296
<212> DNA
<213> 加州腔蚓（Metaphire californica）
<400> 14
aatacaatcg ttacagcaca cgcatttcta ataattttct ttctggtaat gccagtattt 60
attgggggat ttggaaactg actactccca ctaatactag gaaccccaga tatagcattc 120
ccacgactaa ataacatgag attctggcta cttcccccct cgctaatttt attagttagg 180
tctgctgcag tagaaaaggg ggcaggtaca ggatgaacag tatacccacc tctagcaagc 240
aatatagcac acgctgggcc ctcagtagat cttgcaattt tttcactaca tttagc 296
<210> 15
<211> 206
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 15
cttatactag gaacccccga catagcattc ccacgtctaa ataacataag attttgactt 60
ttgccgccat ccttaattct attagtaagg tctgcggctg ttgaaaaggg ggctggtacc 120
ggatgaacag tttacccccc cttagcaaga aacatagcac atgcaggtcc ctctgtagac 180
cttgcaattt tctcactaca tttagc 206
<210> 16
<211> 206
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 16
cttatactag gaacccccga catagcattc ccacgtctaa ataacataag attttgactt 60
ttgccgccat ccttaattct attagtaagg tctgcggctg ttgaaaaggg ggctggtacc 120
ggatgaacag tttacccccc tttagcaaga aacatagcac atgcaggtcc ctctgtagac 180
cttgcaattt tctcactaca tttagc 206
<210> 17
<211> 206
<212> DNA
<213> 参环毛蚓（Amynthas aspergillus）
<400> 17
cttatactag gaacccccga catagcattc ccacgtctaa ataacataag attttgactt 60
ttgccaccat ccttaattct attagtaagg tctgcggctg ttgaaaaggg agccggtacc 120
ggatggacag tttacccccc tttagcaaga aacatagcac atgcgggccc ctctgtagac 180
cttgcaattt tctcactaca tttagc 206
<210> 18
<211> 206
<212> DNA
<213> 加州腔蚓（Metaphire californica）
<400> 18
ctaatactag gaaccccaga tatagcattc ccacgactaa ataacatgag attctggcta 60
cttcccccct cgctaatttt attagttagg tctgctgcag tagaaaaggg ggcaggtaca 120
ggatgaacag tatacccacc tctagcaagc aatatagcac acgctgggcc ctcagtagat 180
cttgcaattt tttcactaca tttagc 206
<210> 19
<211> 232
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 19
ttagtgtcgt ccgccgcagt tgaaaagggt gcaggaacag ggtgaacagt atatccccca 60
ctagcaagaa atattgccca tgctgggcct tcagtagatc tagcaatctt ttcactccat 120
cttgctgggg cgtcatcaat tttgggagct attaatttca tcactacagt aattaatatg 180
cggtgatcgg gactacggtt agaacgaatc ccactatttg tgtgggcagt ag 232
<210> 20
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 20
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 21
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 21
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 22
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 22
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct agcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 23
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 23
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 24
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 24
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 25
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 25
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 26
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 26
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta taccccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct agcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 27
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 27
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta tatcccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188
<210> 28
<211> 188
<212> DNA
<213> 通俗环毛蚓（Metaphire vulgaris）
<400> 28
gaaaagggtg caggaacagg gtgaacagta tatcccccac tagcaagaaa tattgcccat 60
gctgggcctt cagtagatct ggcaatcttt tcactccatc ttgctggggc gtcatcaatt 120
ttgggagcta ttaatttcat cactacagta attaatatgc ggtgatcggg actacggtta 180
gaacgaat 188

Claims (6)

1.一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)脑心通制剂总DNA的提取：用蛋白酶K消化制剂中动物组分，按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分；得总DNA的提取物；
(2)PCR扩增：反应体系为15μL，脑心通制剂总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl2溶液1.5μL，2.5mM dNTPs 1.2μL，地龙特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃或58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述地龙特异性引物包括3个引物对，序列如下：
COI Metaphire F2/R2：COI Metaphire F2：5’-TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT-3’，COIMetaphire R2：5’-CTACTGCCCACACAAATAGTGGG-3’，扩增片段长度为232bp；
COI AA F2/R1：COI AA F2：5’-CTTGGAAGAGATCAGCTATAC-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为337bp；
COI AA F3/R1：COI AA F3：5’-TTTGGAAACTGACTGCTCCCA-3’，COI AA R1：5’-CTAAAATTGATGAGGCACCC-3’，扩增片段长度为247bp；
其中，所述3个引物对中，COI Metaphire F2/R2引物对是针对地龙的Metaphire属设计的特异性引物，该属对应通俗环毛蚓和威廉环毛蚓；COIAA F2/R1和COI AA F3/R1引物对是针对地龙的Amynthas属设计的特异性引物，该属对应参环毛蚓和栉盲环毛蚓；
(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，纯化，测序；
(4)鉴定：将步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种；
对于同一待测样品，地龙正品应同时满足以下2个条件：
A在电泳检测时，待测样品的电泳检测条带与3个引物对中任意一对对应；
B测序后进行BLAST判定，与其相似性最高的序列对应的物种需与将其扩增出条带的引物对对应的物种一致。
2.一种脑心通制剂中Metaphire属地龙药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)脑心通制剂总DNA的提取：用蛋白酶K消化制剂中动物组分，按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分；得总DNA的提取物；
(2)PCR扩增：反应体系为15μL，脑心通制剂总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl2溶液1.5μL，2.5mM dNTPs1.2μL，地龙特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，58℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述地龙特异性引物序列如下：
COI Metaphire F2/R2：COI Metaphire F2：5’-TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT-3’，COIMetaphire R2：5’-CTACTGCCCACACAAATAGTGGG-3’，扩增片段长度为232bp；
(3)电泳检测及鉴定：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，判定待检制剂中的地龙为通俗环毛蚓或威廉环毛蚓。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：步骤(1)中所述蛋白酶K消化制剂中动物药组分的具体操作步骤为：取脑心通制剂细粉，加入所述广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒中供配的缓冲液和蛋白酶K，涡旋振荡，充分混匀后置55℃水浴过夜。
4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述步骤(2)中的10×PCR缓冲液包括以下组分：750mM Tris，pH值为8.8；200mM(NH4)2SO4；15mM MgCl2；0.1％(v/v)Tween 20。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体方法为：取5μL步骤(2)所得的PCR产物与1μL 6×RNA/DNA Loading buffer混合，于1.5％琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳20～30min后，置紫外灯下观察，得单一明亮条带，纯化后测序。
6.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述的脑心通制剂为脑心通胶囊。
CN201910212299.XA 2019-03-20 2019-03-20 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法 Active CN110066878B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910212299.XA CN110066878B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910212299.XA CN110066878B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110066878A CN110066878A (zh) 2019-07-30
CN110066878B true CN110066878B (zh) 2023-06-02

Family

ID=67366399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910212299.XA Active CN110066878B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110066878B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951891A (zh) * 2019-11-15 2020-04-03 牡丹江友搏药业有限责任公司 一种引物组合物及其在鉴定参环毛蚓中的应用
CN110923331B (zh) * 2019-12-03 2023-05-02 牡丹江友搏药业有限责任公司 一种引物对及其在鉴定参环毛蚓中的应用
CN111303263B (zh) * 2020-03-11 2022-07-12 中国药科大学 地龙特征多肽及其在地龙药材种属鉴别中的应用
CN111485025B (zh) * 2020-04-01 2023-09-08 苏州普瑞姆生物科技有限公司 定向鉴定中成药中的中药正伪品方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008056325A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Universidade Do Porto Process for animal species identification in samples with genetic material based on mitochondrial dna size variation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876977A (en) * 1997-01-03 1999-03-02 The Chinese University Of Hong Kong Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism test for the authentication of traditional chinese medicines
CN103898234A (zh) * 2014-04-21 2014-07-02 牡丹江友搏药业股份有限公司 一种地龙的dna条形码分子鉴定方法
CN109136383A (zh) * 2017-06-26 2019-01-04 临沂市科学技术合作与应用研究院 中药材广地龙dna检测试剂盒及其鉴定方法
CN109295170A (zh) * 2018-09-25 2019-02-01 广东省生物资源应用研究所 一种基于pcr-rflp技术鉴定广地龙的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008056325A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Universidade Do Porto Process for animal species identification in samples with genetic material based on mitochondrial dna size variation

Also Published As

Publication number Publication date
CN110066878A (zh) 2019-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110066878B (zh) 一种脑心通制剂中地龙药材的dna分子鉴别方法
JP2004201641A (ja) 真菌検出方法
CN106834467A (zh) 一种地龙的dna条形码分子鉴定方法
CN104498599B (zh) 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN111206106B (zh) 一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法
CN109900871A (zh) 一种脑心通制剂中水蛭药材的dna分子鉴别方法
Gorgani-Firouzjaee et al. Genotype characterization of livestock and human cystic echinococcosis in Mazandaran province, Iran
CN110714087B (zh) 用于同时快速鉴别4种猪绦虫蚴的引物、试剂盒及其鉴别方法
Alajmi Molecular characterization of Fasciola flukes using mitochondrial 28S rRNA gene in Naimi Saudi sheep
CN105543373B (zh) 乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法
CN104831000B (zh) 用于樱桃病毒检测的多重rt‑pcr试剂盒及检测方法
CN108866205A (zh) 基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物
CN105603067A (zh) 基于多重pcr快速鉴定我国外来入侵福寿螺的特异引物对及其应用
CN111443065A (zh) 一种肺癌的筛查试剂盒
CN114574609B (zh) 检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法
CN107058563A (zh) 一种用于检测外周血egfr基因t790m突变的试剂盒及其方法
Barghash Molecular changes in Trypanosoma evansi after treatment against trypanosomosis
CN112980979A (zh) 具核梭杆菌荧光定量检测试剂盒及其制备方法与检测方法
Ayhan et al. Phylogenetic relationships among the Leiurus abdullahbayrami (Scorpiones: Buthidae) populations in Turkey inferred from mitochondrial DNA sequence data
CN108118095A (zh) 一种检测金龙胶囊中蕲蛇成分的质量控制方法
CN110055315A (zh) 一种脑心通制剂中全蝎药材的dna分子鉴别方法
CN106811543A (zh) 一种肺癌miRNA标志物的联合检测试剂盒
CN111041117A (zh) 五加科中药制品鉴别试剂盒和方法
CN114369684B (zh) 用于马病毒性动脉炎病毒实时荧光rt-pcr检测的引物、探针、试剂盒、方法及其应用
Pietersen et al. Identification of Mgeniafuscovaria (Stål)(Hemiptera: Cicadellidae), a vector of aster yellows disease on grapevines in South Africa, and differentiation from Mgenia angusta (Theron) by nucleotide sequences of the mitochondrial cytochrome oxidase I (cox1) gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant