CN110951891A - 一种引物组合物及其在鉴定参环毛蚓中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供了一种用于LAMP扩增的引物组合物，使用所述引物组合物鉴定参环毛蚓的方法，以及用于鉴定参环毛蚓的试剂盒。采用本发明实施例提供的引物组合物，可以特异性扩增参环毛蚓中的DNA片段，从而准确鉴别参环毛蚓。
Description
技术领域
本发明涉及参环毛蚓鉴定技术领域，特别是涉及一种引物组合物及其在鉴定参环毛蚓中的应用。
背景技术
蚯蚓，又称地龙，是一种常见的中药材，其中含有多种生物活性物质，具有抗凝血溶血栓、抗癌、免疫增强、降压、平喘等多种药理作用，其中以参环毛蚓临床疗效确切，在地龙中药材中被公认品质最优。然而目前鉴别参环毛蚓大多依靠个人经验，而地龙品种较多，形态相似，因此难以辨认，故而亟需一种能够快速准确鉴定参环毛蚓的方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种引物组合物，以实现对参环毛蚓的基因片段的特异性扩增，从而准确鉴定参环毛蚓。具体技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种引物组合物，包括四条引物，所述四条引物的核苷酸序列如下：
上游外部引物：5’-CGGAATAAGACTTCTTATTCGTATT-3’；
上游内部引物：5’-CGTGTGCTGTTACAATTGTGTTGTA-ATTAAGACAACCTGGATCCTTC-3’；
下游内部引物：5’-GTAATGCCAGTATTTATTGGCGGG-TATGTCGGGGGTTCCTAG-3’；
下游外部引物：5’-GTTATTTAGACGTGGGAATGC-3’。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的引物组合物在鉴定参环毛蚓中的用途。
本发明第三方面提供了一种利用LAMP扩增技术鉴定参环毛蚓的方法，采用本发明第一方面所提供的引物组合物。
在本发明第三方面的一些实施方式中，利用LAMP扩增技术鉴定参环毛蚓，包括以下步骤：
1)分别提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，分别以各待测样品的总DNA为模板进行LAMP扩增；扩增结果为阳性的待测样品为参环毛蚓。
在本发明第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，每25μL LAMP扩增体系包括：
在本发明第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，LAMP扩增条件为：
64℃孵育30-60分钟，80℃孵育10分钟。
在本发明第三方面的一些实施方式中，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。
本发明第四方面提供了一种用于鉴定参环毛蚓的试剂盒，包含本发明第一方面所提供的引物组合物。
在本发明第四方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括等温扩增反应缓冲液、DEPC水、链置换DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4水溶液，及操作说明书。
采用本发明实施例提供的引物组合物，可以特异性扩增参环毛蚓中的DNA片段，从而准确鉴别参环毛蚓。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用本发明引物组合物对样品编号为1-18的待测样品进行扩增的凝胶电泳结果图；
图2为采用本发明引物组合物对样品编号为19-25的待测样品进行扩增的凝胶电泳结果图；
图3为采用本发明引物组合物对样品编号为1-18的待测样品进行扩增的核酸荧光染色结果(自然光下)；
图4为采用本发明引物组合物对样品编号为19-25的待测样品进行扩增的核酸荧光染色结果(自然光下)；
图5为采用本发明引物组合物对样品编号为1-18的待测样品进行扩增的核酸荧光染色结果(紫外光下)；
图6为采用本发明引物组合物对样品编号为19-25的待测样品进行扩增的核酸荧光染色结果(紫外光下)；
图7为不同模板用量的LAMP扩增的凝胶电泳结果图；
图8为不同扩增时间的LAMP扩增的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明第一方面提供了一种引物组合物，包括四条引物，所述四条引物的核苷酸序列如下：
上游外部引物：5’-CGGAATAAGACTTCTTATTCGTATT-3’(SEQ ID No:1)；
上游内部引物：5’-CGTGTGCTGTTACAATTGTGTTGTA-ATTAAGACAACCTGGATCCTTC-3’(SEQ ID No:2)；
下游内部引物：5’-GTAATGCCAGTATTTATTGGCGGG-TATGTCGGGGGTTCCTAG-3’(SEQ IDNo:3)；
下游外部引物：5’-GTTATTTAGACGTGGGAATGC-3’(SEQ ID No:4)。
所述四条引物按顺序分别命名为dl-F3，dl-FIP，dl-BIP，dl-B3。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的引物组合物在鉴定参环毛蚓中的用途。
本发明第三方面提供了一种利用LAMP扩增技术(即环介导等温扩增技术)鉴定参环毛蚓的方法，采用本发明第一方面所提供的引物组合物。
在本发明第三方面的一些实施方式中，利用LAMP扩增技术鉴定参环毛蚓，包括以下步骤：
1)分别提取待测样品的总DNA；
所述待测样品可以理解为有待鉴定的地龙组织样品，例如地龙的肌肉组织，在本发明第三方面的一些实施方式中，提取待测样品的总DNA后，对总DNA的浓度进行测定，例如采用Nanodrop2000微量核酸定量分析仪对总DNA浓度进行测定，并根据吸光度A260/A280，A260/A230的值判断其DNA纯度，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做限定。
2)采用所述引物组合物，分别以各待测样品的总DNA为模板进行LAMP扩增；扩增结果为阳性的待测样品为参环毛蚓。
所述“阳性”结果可以理解为扩增结果可检测到，例如采用琼脂糖凝胶电泳检测，可观察的到梯状条带，无条带即为阴性结果；采用核酸荧光染料染色，在自然光或紫外光下可观察到荧光即为阳性结果。在本发明第三方面的一些实施方式中，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测具有很高的灵敏度，因此对引物的特异性具有很高的要求，否则可能会出现假阳性结果；正是由于本申请的引物组合物对参环毛蚓具有高度特异性，因此结合核酸荧光染料检测能够快速准确地鉴定参环毛蚓。所述核酸荧光染料为本领域常用试剂，例如SYBR Green I核酸染料，阳性结果在自然光下呈绿色，阴性结果为橙色；本领域技术人员也可根据实际情况选择其他核酸荧光染料，本发明在此不做限定。
在本发明第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，每25μL LAMP扩增体系包括：
余量以DEPC水补齐，此为本领域常用技术手段，本发明在此不做赘述。
链置换DNA聚合酶是用于LAMP扩增的DNA聚合酶，例如Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司)，本领域技术人员也可以根据具体需要选择其他适用于LAMP扩增的DNA聚合酶，本发明在此不做限定。
在本发明第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，LAMP扩增条件为：
64℃孵育30-60分钟，80℃孵育10分钟；其中64℃为扩增温度，80℃为终止温度。
需要说明的是，本发明中所使用的引物dl-F3，dl-FIP，dl-BIP，dl-B3由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，扩增体系中除模板和引物之外的试剂以及扩增结果检测所需的试剂均市售可得，本发明所说的DEPC水也称无酶水，即不含RNA酶、DNA酶及蛋白酶的水，此为本领域常规试剂，本发明在此不做限定。
本发明第四方面提供了一种用于鉴定参环毛蚓的试剂盒，包含本发明第一方面所提供的引物组合物。
在本发明第四方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括等温扩增反应缓冲液、DEPC水、链置换DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4水溶液，及操作说明书。
实施例
一、试剂
通用引物LCO1490和HCO2198以及引物dl-F3，dl-FIP，dl-BIP，dl-B3由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；dNTP Mixture(即dNTPs)(TaKaRa公司)；DEPC水(Biosharp)；琼脂糖(Lonza)；无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；6×Loading Buffer(TaKaRa公司)；10000×SYBR GreenI核酸染料(北京索莱宝科技有限公司)；DuRed核酸染料(北京泛博生物化学有限公司)；D2000 DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；TAE(50×)(合肥志宏生物技术有限公司)；Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶(纽英伦生物技术有限公司，配套试剂中包含10×等温扩增反应缓冲液)；Tks Gflex DNA聚合酶以及2×Gflex PCRBuffer(2×Gflex PCRBuffer中包含dNTPs)(TaKaRa)。
二待测样品物种鉴定
1、待测样品COⅠDNA片段获取
采集不同产地的地龙样品25份(即待测样品)，分别剪取各地龙样品肌肉组织约30mg，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书提取总DNA，采用Nanodrop2000微量核酸定量分析仪测定浓度，总DNA浓度约400ng/μL。采用COⅠ(细胞色素氧化酶Ⅰ)通用引物LCO1490(SEQ ID No:5)和HCO2198(SEQ ID No:6)，分别以各待测样品总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为：
扩增条件为：预变性98℃1分钟；变性98℃10s，退火52℃15s，延伸68℃30s，40个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟，获得待测样品COⅠDNA片段，产物长度658bp。
2、Sanger测序确定待测样品物种
对引物LCO1490和HCO2198扩增后的产物，进行Sanger测序，测序工作由北京华大基因完成。测序结果在NCBI上进行Blast鉴定物种，鉴定结果见表1。
表1
3、采用本发明引物组合物对待测样品进行鉴定
以待测样品的总DNA为模板，采用本申请的引物组合物对其进行LAMP扩增，扩增体系为：
扩增条件为：64℃，60分钟；80℃，10分钟。
取反应产物5μL，加入6×Loading buffer 5μL(Takara公司)，混匀后于DU Red核酸染料染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，110V，电泳30分钟，经凝胶成像系统成像，结果如图1和图2所示。图1和图2中M代表为marker(分子量标记物)，标号1-25分别为样品编号为1-25的待测样品，N1、N2分别为阴性对照(DEPC水)。从图1、图2中可以看出，标号1、2、5、6、7、10、12、13、14、17、18、19、20、22、25所对应的样品可观察到梯状条带，即为阳性结果，说明这些样品编号对应的待测样品为参环毛蚓，此结果与Sanger测序结果一致，说明本发明的引物对能够准确鉴定参环毛蚓。
取反应产物20μL，加入0.2μl 10000×SYBR GreenⅠ，在自然光下观察结果如图3和图4所示，标号1-25分别为样品编号为1-25的待测样品，N1、N2分别为阴性对照(DEPC水)。其中标号1、2、5、6、7、10、12、13、14、17、18、19、20、22、25所对应的样品呈绿色，即为阳性结果，该结果与电泳结果一致；将加入SYBR GreenⅠ的反应产物在254nm紫外灯下观察，结果如图5和图6所示，其中标号1、2、5、6、7、10、12、13、14、17、18、19、20、22、25所对应的样品可观察到绿色荧光，该结果也与电泳结果一致。说明采用核酸荧光染料能够准确检测扩增结果。
实施例二 LAMP扩增灵敏度考察
选取一条经分子鉴定为正品地龙参环毛蚓样品(样品编号1)进行灵敏度考察，分别以样品总DNA原液(约400ng/μl)、1：10、1：100、1：1000、1：10000稀释液为模板，按实施例一中的LAMP扩增体系和扩增条件进行扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图7所示。图中M代表为marker(分子量标记物)，标号1-5分别代表扩增体系中的模板分别为原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液和10000倍稀释液；从结果中可以看出，模板DNA在稀释10000倍(浓度约0.04ng/μl)后仍能扩增出条带，说明本发明的引物组合物具有较高的灵敏度。
实施例三 LAMP扩增反应时间考察
选取一条经分子鉴定为正品地龙参环毛蚓样品(样品编号1)进行扩增时间考察，采用实施例一中的LAMP扩增体系和扩增条件，区别仅在于扩增时间分别设置为0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min，并采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，电泳结果如图8所示。图中M代表为marker(分子量标记物)，标号1-7分别代表反应时间为0-60分钟的样品扩增结果，N为阴性对照(DEPC水)；从结果中可以看出，扩增时间达到30min时即有条带产生，反应在50min及60min时扩增效果最佳。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 牡丹江友搏药业有限责任公司
天津中医药大学
<120> 一种引物组合物及其在鉴定参环毛蚓中的应用
<130> PP192837
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaataaga cttcttattc gtatt 25
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtgtgctgt tacaattgtg ttgtaattaa gacaacctgg atccttc 47
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaatgccag tatttattgg cgggtatgtc gggggttcct ag 42
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttatttaga cgtgggaatg c 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26
Claims (9)
1.一种引物组合物，包括四条引物，其特征在于，所述四条引物的核苷酸序列如下：
上游外部引物：5’-CGGAATAAGACTTCTTATTCGTATT-3’；
上游内部引物：5’-CGTGTGCTGTTACAATTGTGTTGTA-ATTAAGACAACCTGGATCCTTC-3’；
下游内部引物：5’-GTAATGCCAGTATTTATTGGCGGG-TATGTCGGGGGTTCCTAG-3’；
下游外部引物：5’-GTTATTTAGACGTGGGAATGC-3’。
2.如权利要求1所述的引物组合物在鉴定参环毛蚓中的用途。
3.一种利用LAMP扩增技术鉴定参环毛蚓的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的引物组合物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，分别以各待测样品的总DNA为模板进行LAMP扩增；扩增结果为阳性的待测样品为参环毛蚓。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，每25μL LAMP扩增体系包括：
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，LAMP扩增条件为：
64℃孵育30-60分钟，80℃孵育10分钟。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用核酸荧光染料对扩增结果进行检测。
8.一种用于鉴定参环毛蚓的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1所述的引物组合物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括等温扩增反应缓冲液、DEPC水、链置换DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4水溶液，及操作说明书。
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2019
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