CN109136383A - 中药材广地龙dna检测试剂盒及其鉴定方法 - Google Patents
中药材广地龙dna检测试剂盒及其鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种广地龙检测试剂盒及其制备方法。包括基因组提取体系、PCR反应体系及检测体系三部分组成。包括样品前处理，基因组提取，PCR反应及结果鉴定等步骤，地龙的样品前处理分为干样品和湿样品。地龙DNA检测方法是设计地龙基因组特异性寡聚核苷酸引物，人工合成引物，确定反应程序和结果判断等步骤。能够从药用地龙状原料中准确的判断出是否是地龙。鉴定方法简便、快捷，鉴定结果可靠。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，更具体的说，是一种地龙DNA检测试剂盒及其鉴定方法。
背景技术
地龙是可以作为药用的蚯蚓，是常用的动物类中药。从我国地龙的药源调查和商品鉴定中发现：我国地龙药材的原动物主要有13个种和变种，分别隶属于钜蚓科、正蚓科和链胃蚓科4个属。除了药典收集记载的品种外，还包括湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、白经环毛蚓等。由于药用地龙的原动物品种较多，目前尚缺乏真实有效的鉴定方法，导致各地市场上出现广地龙药材品种混杂，药材品质优劣参差不齐等问题，严重影响了临床疗效并给服用者留下健康隐患。韦健红在《地龙药材DNA条形码分子鉴定的研究》中采用COI基因序列及16SrRNA基因对广地龙及其他地龙原动物共3个科5个属9个物种的进行了序列比较研究，同时探讨了12SrRNA基因和Cytb基因对地龙原动物分子鉴定的可行性。从中筛选出适用于地龙物种鉴定的DNA条形码。这种方法无疑对于进行学术型的种属鉴定，是适宜的，但就操作性来讲却有失简便。序列对比发现这4个基因在其他类型的地龙甚至其他生物中同源性较高，在使用中除非进行DNA测序，否则很难确定是药用蚯蚓甚至是蚯蚓，而且DNA测序成本高，耗时长。基于此，本发明提供一种更加简便快捷且准确度高的药用广地龙的检测试剂盒及其试用方法。
发明内容
金属硫蛋白是具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质，它普遍存在于生物体内。参环毛蚓在中国习称广地龙，通过序列比对发现参环毛蚓的金属硫蛋白（metallothionein）与其他物种同源性低。本发明基于本蛋白的特异性，提供一种能够在繁杂的地龙药材中准确鉴别广地龙与牛肠、羊肠、鸭肠和鸡肠的特异性，使用方便的地龙试剂盒，并提供其简单、快速、检测结果可靠的鉴定方法。
本发明的目的是由以下技术方案来完成的：具体为一种地龙鉴定试剂盒，包含：
（a）鉴定反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL,0.1mM引物1或引物2中的一种 1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，待检样本1-5μL，用去离子水补齐体系。
（b）阳性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，地龙DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。
（c）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，用去离子水补齐体系。
（d）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，牛、羊、鸡、鸭肠子1:1:1:1混合DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。
本发明的第二个目的在于提供了一种广地龙的鉴定方法，包含如下步骤：
（1）设计广地龙特异性寡聚脱氧二核苷酸引物，含有地龙DNA序列：如下引物1或2中的一种：
引物1
5' GCGAGAAACTCTTTGTGGCG 3'
5' GGAACTGCCGAAAGGCAAAA 3'
引物2
5' ATTGTTGTGGCTCAGCAGGA 3'
5' AATAAGCAAGCGGAACTGCC 3'
（2）人工合成广地龙特异性寡聚脱氧二核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三脂合成；
（3）确定反应程序，分别将广地龙DNA检测试剂盒（a）鉴定反应体系，（b）阳性对照反应体系和（c）和（d）阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：
引物1：94℃预变性5min后，经过30-35个循环，每个循环包括：94℃ 50s,60℃ 30s,72℃ 30s,最后72℃延伸5-8min,4℃；
引物2：94℃预变性5min后，经过30-35个循环，每个循环包括：94℃ 50s,55℃ 30s,72℃ 30s,最后72℃延伸5-8min, 4℃；
（4）结果判定
反应产物使用1.5%的琼脂糖凝胶，在DYY-111型水平电泳仪上电泳，80-100mV电泳20-30min,分子量100-600bp的DNA marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。
与现有技术相比本发明的地龙鉴定试剂盒是利用地龙金属硫蛋白的特异性，能够准确区分与地龙易混的其他动物材料制造的伪地龙的特异性；鉴定方法具有简便、快捷、检测结果可靠的优势。
附图说明
图1为引物1检测地龙与牛肠、羊肠、鸡肠和鸭肠结果图。
其中：1为DNA marker；2为阳性对照为384bp，3为阴性对照，4为待检样本阳性结果；5为待检样品阴性结果
图2为引物2检测地龙与牛肠、羊肠、鸡肠和鸭肠结果图。
其中：6为1为DNA marker；7为阴性对照，8为阳性对照为224bp，9为待检样本阳性结果，10为待检样本阴性结果；
具体实施方式
下面利用实施例对本发明进行进一步的描述
实施例1：一种广地龙DNA检测试剂盒，其包含：
（a）鉴定反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各5μL, 0.1mM引物11μL，TaqDNA聚合酶1μL，待检样本1μL，用去离子水补齐体系。
（b）阳性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各5μL,0.1mM引物1 1μL，TaqDNA聚合酶1μL，广地龙DNA1μL ，用去离子水补齐体系。
（c）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各5μL,0.1mM引物1 1μL，TaqDNA聚合酶1μL，用去离子水补齐体系。
（d）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各5μL,0.1mM引物1 1μL，TaqDNA聚合酶1μL，牛、羊、鸡、鸭肠子1:1:1:1混合DNA1μL ，用去离子水补齐体系。
鉴定反应体系，阳性对照体系，阴性对照体系所用的缓冲液为现有试剂，缓冲液体系包含：500mM Tris-HCl （pH8.4）,15mM Mgcl2,市场有售，12.5 mM dNTP 为12.5mM脱氧核苷三磷酸，市场有售，TaqDNA聚合酶，市场有售；
广地龙的鉴定方法，它包含下述步骤：
（1）剥取新鲜或干燥广地龙组织0.3g，冲洗干净，用无菌纸吸干，置于液氮中研磨。
（2）将研碎的样品置于500μL裂解液中，迅速置于65℃水浴孵育，直至样品完全溶解。
（3）溶解完全后冷却至室温，加等体积蛋白抽提液，轻柔颠倒混匀。
（4）室温12000rpm离心10min，收集上清。
（5）加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1h。
（6）4℃,12000 rpm离心20min。
（7）弃上清，沉淀用70%乙醇清洗2次，在通风橱中晾干，加入50μL无菌水溶解DNA。
（8）1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，蛋白核酸紫外分析仪测定DNA浓度。
（9）设计广地龙特异性引物，要求只含有地龙的DNA序列，不包含有牛肠、猪肠、鸡肠、鸭肠的DNA序列，如下引物1：
引物1
5' GCGAGAAACTCTTTGTGGCG 3'
5' GGAACTGCCGAAAGGCAAAA 3'
（10）人工合成广地龙特异性寡聚脱氧二核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三脂合成；
（11）确定反应程序
分别将地龙DNA检测试剂盒（a）鉴定反应体系，（b）阳性对照反应体系和（c）和（d）阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：
引物1：94℃预变性5min后，经过30个循环，每个循环包括：94℃ 50s,60℃ 30s,72℃30s,最后72℃延伸8min,4℃；
（12）结果判定
反应产物使用1.5%的琼脂糖凝胶，在DYY-111型水平电泳仪上电泳，80-100mV电泳20-30min,分子量100-600bp的DNA marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。
参照图1：1.标准分子量为引物1检测广地龙、牛肠、羊肠、鸡肠、鸭肠的结果，只有地龙出现阳性结果。
实施例2：一种广地龙DNA检测试剂盒，其包含：
（a）鉴定反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各15μL, 0.1mM引物1或引物2中的一种3μL，TaqDNA聚合酶5μL，待检样本5μL，用去离子水补齐体系。
（b）阳性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各15μL,0.1mM引物2 3μL，TaqDNA聚合酶5μL，地龙DNA5μL ，用去离子水补齐体系。
（c）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各15μL,0.1mM引物2 3μL，TaqDNA聚合酶5μL，用去离子水补齐体系。
（d）阴性对照反应体系：总体系为100μL, 缓冲液10μL，10 mM dNTP混合物各15μL,0.1mM引物2 3μL，TaqDNA聚合酶5μL，牛、羊、鸡、鸭肠子1:1:1:1混合DNA5μL ，用去离子水补齐体系。
鉴定反应体系，阳性对照体系，阴性对照体系所用的缓冲液为现有试剂，缓冲液体系包含：500mM Tris-HCl （pH8.4）,15mM Mgcl2,市场有售，12.5 mM dNTP 为12.5mM脱氧核苷三磷酸，市场有售，TaqDNA聚合酶，市场有售；
地龙的鉴定方法，它包含下述步骤：
（1）剥取新鲜或干燥地龙组织0.3g，冲洗干净，用无菌纸吸干，置于液氮中研磨。
（2）将研碎的样品置于500-600μL裂解液中，迅速置于65℃水浴孵育，直至样品完全溶解。
（3）溶解完全后冷却至室温，加等体积蛋白抽提液，轻柔颠倒混匀。
（4）室温12000rpm离心10min，收集上清。
（5）加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1h。
（6）4℃,12000 rpm离心20min。
（7）弃上清，沉淀用70%乙醇清洗2-3次，在通风橱中晾干，加入50μL无菌水溶解DNA。
（8）1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，蛋白核酸紫外分析仪测定DNA浓度。
（9）设计广地龙特异性引物，要求只含有地龙的DNA序列，不包含有牛肠、猪肠、鸡肠、鸭肠的DNA序列，如下引物2：
引物2
5' ATTGTTGTGGCTCAGCAGGA 3'
5' AATAAGCAAGCGGAACTGCC 3'
（10）人工合成广地龙特异性寡聚脱氧二核苷酸引物，采用ABI3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三脂合成；
（11）确定反应程序
分别将地龙DNA检测试剂盒（a）鉴定反应体系，（b）阳性对照反应体系和（c）和（d）阴性对照反应体系的总体系各100μL加入反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：
引物2：94℃预变性5min后，经过35个循环，每个循环包括：94℃ 50s,55℃ 30s,72℃30s,最后72℃延伸8min, 4℃；
（12）结果判定
反应产物使用1.5%的琼脂糖凝胶，在DYY-111型水平电泳仪上电泳，80-100mV电泳20-30min,DNA marker作参照，凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。
参照图1：1.标准分子量为引物1检测地龙、牛肠、羊肠、鸡肠、鸭肠的结果，只有地龙出现阳性结果。
参照图2：为引物2检测地龙、牛肠、羊肠、鸡肠、鸭肠的结果，只有地龙出现阳性结果。
Claims (10)
1.一种广地龙鉴定试剂盒，其特征在于：包含鉴定反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系1、阴性对照反应体系2、蛋白抽提液和蛋白裂解液。
2.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的鉴定反应体系为100μL，包含缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各1-2μL， 0.1mM正向引物的5‘GCGAGAAACTCTTTGTGGCG’3和反向引物5 ‘GGAACTGCCGAAAGGCAAAA’3为1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，待检样本1-5μL，用去离子水补齐体系。
3.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照反应体系为总体系为100μL，缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL， 0.1mM引物1的5‘GCGAGAAACTCTTTGTGGCG’3和引物5 ‘GGAACTGCCGAAAGGCAAAA’3为1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，地龙基因组DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。
4.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：阴性对照反应体系1为总体系为100μL，缓冲液10μL，0.2 mM dNTP混合物各5-15μL， 0.1mM引物1的5‘GCGAGAAACTCTTTGTGGCG’3和引物5 ‘GGAACTGCCGAAAGGCAAAA’3为1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，用去离子水补齐体系。
5.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：阴性对照反应体系2为阴性对照反应体系：总体系为100μL，缓冲液10μL，0.2mM dNTP混合物各5-15μL， 0.1mM引物1的5‘GCGAGAAACTCTTTGTGGCG’3和引物5 ‘GGAACTGCCGAAAGGCAAAA’3为1-3μL，TaqDNA聚合酶1-5μL，牛、羊、鸡、鸭肠子1:1:1:1混合DNA1-5μL ，用去离子水补齐体系。
6.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的蛋白裂解液为：20mMTris-HCl pH8.0；20mM EDTA pH8.0；4%SDS；2%巯基乙醇；0.5M Nacl；50μg/μL蛋白酶K 。
7.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的蛋白抽提液为：以质量体积比计算，氯仿：异戊醇=18-26：1。
8.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的蛋白抽提液为：以质量体积比计算，氯仿：异戊醇=24：1。
9.利用权利要求1-5的任意一一种地龙鉴定试剂盒进行地龙鉴定的方法，特征在于其包括如下步骤：
（1）剥取新鲜或干燥地龙组织0.3-0.8g，冲洗干净，用无菌纸吸干，置于液氮中研磨；
（2）将研碎的样品置于500-600μL裂解液中，迅速置于65℃水浴孵育，直至样品完全溶解；
（3）溶解完全后冷却至室温，加等体积蛋白抽提液，轻柔颠倒混匀；
（4）室温12000rpm离心10-15min，收集上清；
（5）加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1-2h；
（6）4℃，12000 rpm离心20-30min；
（7）弃上清，沉淀用70%乙醇清洗2-3次，在通风橱中晾干，加入40-80μL无菌水溶解DNA；
（8）1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，蛋白核酸紫外分析仪测定DNA浓度；
（9）PCR反应检测，按照权利要求以所述的反应体系，反应条件：94℃预变性5min后，经过30-35个循环，每个循环包括：94℃ 50s，60℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸10min，产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
10.权利要求1所述的一种地龙鉴定试剂盒，其特征在于：所述的鉴定试剂盒用于地龙的检测。
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