CN104745699A

CN104745699A - 当归的检测试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN104745699A
Application number: CN201510142132.2A
Authority: CN
Inventors: 傅俊江; 梅志强; 张春; 成竞梁
Original assignee: LUZHOU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: LUZHOU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2015-03-27
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-27
Also published as: CN104745699B

Abstract

本发明公开了当归的核苷酸序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途，以及当归的检测试剂盒和检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别当归，特异性强，耗时短，应用前景良好。

Description

当归的检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种当归的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

当归，是伞形科植物当归Angelica Sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，原主产地在我国甘肃东南部，其中以岷县产量多，质量好，其次为云南、四川、陕西、湖北等省，均为栽培。国内其它省区也已有引种栽培。其根可入药，是最常用的中药之一。具有补血和血、调经止痛、润燥滑肠之功效。

欧当归和日本当归是常见的当归伪品。欧当归(Levisticum officinalisKoch)根茎可入药，有兴奋、发汗、利尿、解热等功效，在河北、山东、河南、陕西、山西、江苏等省区均有种植栽培，民间用以代当归用，但是其有当归不具有的不良反应，不能混充当归药用。日本当归(Angelica acutiloba(Sieb.et Zucc.)Kitagawa)在我国吉林省的延吉、珲春、和龙等县栽培作“当归”使用已有长久的历史。国内有些省区也已有引种栽培。模式标本产于日本中部横须贺近郊,日本和朝鲜以本种称当归，栽培入药。功效与我国原产当归类似，主治月经不调，经来腹痛，腰痛、崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等症。日本当归化学成分、有效含量均有较大的差异，而且在药理作用上也有较大的不同之处。

总之，欧当归和日本当归本的药效和当归虽有相似之处，但是在很多功效上有区别，且存在用药安全性问题，不能作为当归使用，然而，由于欧当归、日本当归与当归的性状特征较为相似，通过观察外观形状和显微特性进行鉴别的难度较大，而且欧当归和日本当归易于栽培，产量较高，导致市面上存在许多用欧当归和日本当归以次充好的情况，急需改善。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的、方便、快速、准确地检测当归的试剂盒和方法。

本发明提供了SEQ ID NO.1所示的种核苷酸序列。

本发明还提供了检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途。

所述检测SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

所述当归是伞形科植物当归Angelica Sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。

所述当归是甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归或四川绵阳当归。

所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本发明检测当归的试剂盒，包括检测SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的相关试剂。

所述试剂包括扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

所述扩增的试剂包括SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本发明一种当归的检测方法，包括如下步骤：

a，DNA提取：提取待检样本中的DNA；

b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。

本发明SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为当归特异性序列，通过检测这些序列可以有效区分当归与当归伪品，鉴定待检样本是否为当归，保证用药安全，本发明方法操作简便，具有良好的应用前景。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本发明保护的内容。

附图说明

图1.各种当归的改良RAPD扩增。引物SBS-A1的RAPD扩增。箭头为A1-0的RPAD片段，用于胶回收和克隆。

图2阳性克隆的菌落PCR鉴定。蓝色所指通道的阳性克隆用于Sanger测序。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。泳道1-7分别代表不同阳性克隆的菌落。

图3不同物种及当归品种的鉴定。通道1-18号分别为甘肃岷县当归，日本当归，四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。蓝色所指的通道7为日本当归，通道2为欧当归。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。

具体实施方式

实施例1 RAPD技术扩增当归特异SCAR标记

一、CTAB法提取植物DNA

取当归0.2g置于1.5mL EP管中，加入液氮约半分钟后用研钵棒碾碎成细粉，立即加入500μl的CTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol.L_¹，EDTA20mmol mmol.L_¹，NaCL 1.4mol.L_¹，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提，轻颠倒混匀，10000转每分钟离心10分钟，吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000转每分钟离心10分钟，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的1×TE溶液溶解备用。将样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用分光光度计测定浓度，稀释至浓度10ng/μl，-20℃保存备用。详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。

二、RAPD技术PCR扩增

利用RAPD技术进行扩增(参照Fu J,Yang L,Khan MA,Mei Z(2013)Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by usingimproved RAPD analysis.Mol Biol Rep,40(10):5993-9)：

以步骤一提取的核酸作为模板，用RAPD引物SBA-A1和SBS-A2进行扩增(序列见表2，北京赛百盛公司合成)，PCR扩增采用10μl反应体系包括：1μl的引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCR TaqMastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl的灭菌双蒸水。充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(Applied Biosystems 96-WellThermal Cycler，Life Technology,USA)。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分钟，其中RAMP为5％。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，曝光显色。

表1

琼脂糖凝胶电泳(参见《精编医学分子生物学实验指导》，中国医药科技出版社，主编：傅俊江)：

(1)制备1.5％的琼脂糖凝胶，将PCR产物按顺序全部点样到凝胶孔内，同时点样一个DNA分子大小标记(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加载样缓冲液，PCR扩增用的2×mix就预加了相关成分。

(2)电泳(电泳仪由北京百晶生物有限公司生产，BG-subMID Icell)，常选择电压110V，电泳时间30min即可，

三、RAPD扩增条带的分离

1.片段回收

1.5％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下剪切图正品当归品种的特异片段A1-0，用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物公司)回收RAPD扩增的DNA片段。

2.克隆

接着利用pGEM-T载体(Promega Corporation)和回收RAPD扩增的DNA片段在T4-DNA连接酶作用下连接(16℃连接8小时)。连接后加入30μl活化的DH5α细菌，冰浴30分钟，接着42℃激活45秒，然后冰浴2分钟，再加入300μl无氨苄青霉素的LB培养基(配制方法：12.5克LB粉加500ml水高温灭菌)200转每分钟摇动45分钟，然后将液体均匀涂抹在含氨苄青霉素的固体LB培养基表面，37℃培养15小时[固体培养基配制方法：12.5克LB粉，7.5克琼脂粉和500毫升水高温灭菌后，在50℃时加入500μl的氨苄青霉素(100mg/ml)，使用前在固体培养基表面涂抹40μl的20mg/ml的X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和20μl的24mg/ml的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)]进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR鉴定。

3.阳性克隆鉴定

每个皿挑选多个白色菌落，分别加入到300μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，220转每分钟摇2-4小时，取0.2～0.5μl培养基进行菌落PCR反应。10μl体积的反应体系是：2×PCR Taq Mastermix 5μl，DNA 0.5μl，通用引物(SP6+T7)1μl(2.5μmol/L)，水3.5μl。PCR反应条件是：95℃1分30秒，94℃40秒，58℃30秒，72℃40秒，30个循环，最后72℃5分钟。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色、曝光显色。

4.结果

改良RAPD扩增见图1。阳性克隆的菌落PCR扩增和电泳鉴定结果如图2。

四、测序分析

1.测序

挑选阳性克隆，进行Sanger测序。测序的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1所示)：

CAGGCCCTTTATCGGCTACGGACTAATAAACAATGCCAACACAAGAAAATATCAACACCTCACTATAATAAAAGGGTCAATAGAAATTAGGGTTTTGATTTTAAAAAACCCCCAAATTAAAGCTTACCAATTTCAGTAGAGAAGGCCCTAGAAATAGTATAGGAGACCCTATTCGTGCAGAGAACACCCAAATTAAAGCTTACCAATTTGGACACGAGCAAAGGAGAGACGGGAGCAGAGGTGTTTGGTAATGGTGGTGAGTAGAGAAGGACGGAGGTGAGTAGAACAGAGGTGAGTGGTGGTGGTGGTG。

2.同源性搜寻与查新

将测序获得的如上序列，在NCBI网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行比对，未见相同或者重复序列，说明如它为新的、当归特有的核苷酸序列，可建立当归特异的SCAR标记。

实施例2 用本发明方法特异扩增当归的基因

1、实验方法

(一)根据实施例1得到的当归特异的SCAR标记(SEQ ID NO.1所示的序列)，设计1对引物，合成。

(二)PCR扩增

1、取选取了18个不同物种或者品种基因组DNA作为模板，它们分别是：甘肃岷县当归，日本当归，四川阿坝当归，甘肃平凉当归，湖北当归，四川九寨当归，欧当归，云南丽江当归，四川绵阳当归，银杏，荔枝，龙眼，青果，金银花，栀子花，灵芝，龙荔，赶黄草。分别稀释成10ng/μl备用。基因提取方法同实施例1。

2、PCR扩增：

(1)PCR体系(10μl)

充分混匀后，于离心机12000rpm离心15s，置于PCR仪(AppliedBiosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR扩增条件

31次循环

5 72℃ 5min

6 4℃保温

3、琼脂糖凝胶电泳(胶浓度根据其目的片段的大小而定)。

详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)

(1)脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入1×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入EB 2μl，混匀，待冷却至50℃备用；

(2)用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

(3)点样：

(4)100V电泳45min；

4、图像摄取：(BIO-RAD，Universal Hood Ⅱ)

二、实验结果

如图3所示，本发明设计的引物可以从甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归和四川绵阳当归中扩增出特异性片段，而阿坝当归没有特异性条带，伪品当归如欧当归和日本当归没有扩增出特异性条带，其他品种植物基因组也没有扩增出任何条带，阿坝当归也没有扩增出特异性条带。

实验结果说明，本发明SEQ ID NO.2～3所示引物的特异性良好，可以有效扩增正品当归中的甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归和四川绵阳当归，而不会扩增伪品当归，可以用于正品当归，特别是甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归和四川绵阳当归的鉴别。

实施例3 本发明当归检测试剂盒和使用方法

一、试剂盒组成

本试剂盒含有：

CTAB提取缓冲液(200ml)；

2×Taq Master Mix，其中，引物可以选用SEQ ID NO.5～6、SEQ IDNO.7～8、SEQ ID NO 9～10所示引物中的一对引物或者多对引物(500μl)；

阴性对照模板DNA(日本当归或欧当归的DNA)一管(50μl)；

阳性对照模板DNA(当归DNA)一管(50μl)；

灭菌ddH₂O(1500μl)。

(一)CTAB提取缓冲液

CTAB提取缓冲液(100ml)

(二)PCR体系2×Taq Master Mix的配方

二、检测方法

(一)PCR扩增

1、CTAB提取缓冲液提取待检样本DNA。

2、进行PCR扩增：

具体如下：

不同品种DNA 1μl(50ng/μl)

2×Taq Master Mix 5μl

ddH₂O 4μl

充分混匀后，12000rpm离心30s；

注：2×Taq Master Mix，同时取不同DNA模板设定阳性和阴性对照

3、放入PCR仪上(Mastercycler 5331PCR仪器，德国Eppendorf，或者其它PCR仪器如Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler)，采用如下程序。

31次循环

5 72℃ 5min

6 4℃保温

(二)琼脂糖凝胶电泳：

1、脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入0.5×TAE 40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入EB 2ul，混匀，待冷却至50℃备用；

2、用0.75mm 16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；

3、点样：注意加样顺序，并加上DNA的分子Marker

4、100V电泳45min；

(三)结果检测与分析

在凝胶成像仪下观察结果，结果照相保存，并分析结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以有效鉴定当归，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的临床应用前景。

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.检测SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的试剂在制备当归检测试剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测试剂包括扩增SEQID NO.1所示核苷酸序列的试剂。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述扩增的试剂包括SEQ IDNO.2～3所示的引物对。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述当归是伞形科植物当归Angelica Sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述当归是甘肃岷县当归、甘肃平凉当归、四川九寨当归、云南丽江当归或四川绵阳当归。

7.一种检测当归的试剂盒，其特征在于：包括检测SEQ ID NO.1所述核苷酸序列的相关试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂包括扩增SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增的试剂包括SEQID NO.2～3所示的引物对。

10.一种检测当归的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

a，DNA提取：提取待检样本中的DNA；

b，检测：用权利要求7～9任意一项所述的试剂盒检测待检样本，即可。