CN105400900A - 焦磷酸测序技术检测braf基因v600e微量突变试剂盒及其应用 - Google Patents

焦磷酸测序技术检测braf基因v600e微量突变试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明主要涉及分子病理诊断领域，提供一种用于准确检测BRAF基因V600E微量突变的试剂盒。该试剂盒主要包括2条特异扩增引物，1条阻滞引物，1条测序引物，链霉素标记的亲和磁珠，应用该试剂盒可准确检测BRAF基因V600E低至0.1％的微量突变。本发明检测方法不仅灵敏度高，可检测低至0.1％的突变，而且结果直观，判读更加简单、准确、快速，大大降低检测结果的假阴性率，避免临床上患者无效的靶向药物选择，为患者节省宝贵的治疗时间，提高患者生活质量。

Description

焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒及其应用
技术领域
本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒及其应用。
背景技术
BRAF基因突变发生在近2％的人类肿瘤中，主要发生于结肠癌，黑色素瘤中。据统计，约5％的结直肠癌患者中存在体细胞BRAF基因突变，其中最常见的是第1799位核苷酸上(T突变为A)的突变导致其编码的缬氨酸由谷氨酸代替(V600E)。
Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。
在使用爱必妥或帕尼单抗等靶向药物时，须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态；在治疗黑色素瘤患者，使用Vemurafenib药物前应检测BRAF基因突变状态，BRAF基因突变阳性患者疗效显著。未经靶点检测或检测结果假阴性或假阳性而盲目用药不仅可能导致高额的经济损失，还可能会贻误宝贵的治疗时机，甚至导致病情恶化。
目前常用的BRAF基因V600E突变检测试剂盒，主要包括传统的Sanger测序法和ARMS法。传统的Sanger测序法虽然具有结果准确，判读直观等优点，但是存在操作繁琐，且阳性检出率低的问题；而ARMS法，虽然操作简单，但是检测方法敏感度只有1％，仍然存在阳性检出率低的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种利用焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒的应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种检测BRAF基因V600E微量突变的引物，包括如下引物序列：
(1)扩增BRAF基因包含第600位密码子的引物：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
(2)阻滞引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
(3)测序引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
其中，引物SEQIDNO：2在5末端进行生物素标记。
以上组分在一次检验中共同使用。
上述BRAF基因V600E微量突变的引物在制备检测BRAF基因V600E微量突变的试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂；
(2)反应液：PCRBuffer，引物SEQIDNO：1～310μmol/L，2mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTPs，2U/μLTaqDNA聚合酶；
(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP，SEQIDNO：4所示测序引物10μmol/L。
上述检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒的试剂盒在利用焦磷酸测序法检测BRAF基因V600E微量突变中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种利用焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，SEQIDNO：1～2所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增BRAF基因包含第600位密码子的片段；
(3)将步骤(2)得到的BRAF基因包含第600位密码子的片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序得到基因突变频率。
步骤(2)中，所述的PCR扩增，
其PCR体系为50μL：10×PCRbuffer5μL，SEQIDNO：10.3μL，SEQIDNO：20.3μL，SEQIDNO：33μL，基因组DNA3μl，dNTPs0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，TaqDNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；
其PCR条件为：94℃5min；94℃40s，60℃40s，72℃40s，60个循环；72℃3min。
本试剂盒中阻滞引物与野生型模板完全匹配，而与突变型模板存在一个碱基的错配，其主要作用原理如下：PCR扩增退火步骤中，因Tm值差异，该阻滞引物与野生型模板的结合效率将高于与突变模板的退火效率，通过退火效率的不同带来的偏向扩增，从而达到抑制野生型模板扩增的目的。
本试剂盒借用焦磷酸测序技术和PCR扩增阻滞技术，开发了一种焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒及方法，可以检测低至0.1％的微量突变。
有益效果：本发明一种焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒及其应用，应用焦磷酸测序技术可以准确定量突变位点的突变频率，可用于临床靶标位点BRAF基因V600E突变检测。本发明方法操作简单，敏感性高，降低了样本取材要求，结果易于判读，大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率，为患者避免无效有害的治疗，节省宝贵的治疗时间。
附图说明
图1为1例组织标本BRAF基因V600E突变检测结果图，未发生突变。
图2为1例组织标本BRAF基因V600E突变检测结果图，发生突变。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂。
(1)DNA提取试剂：
购自QIAGEN公司。
(2)反应液：
PCRBuffer：购自美国Fermentas公司；
引物SEQIDNO：1～12，由上海英俊生物科技有限公司合成；
MgCl2：购自美国Fermentas公司；
0.2mMdNTPs：购自美国Fermentas公司；
2U/μLTaqDNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；
0.2MNaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；
10mMTris-Acetate(pH7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；
结合缓冲液：由10mMTris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mol/LNaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mMEDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween20(购于美国Sigma公司)组成；
退火缓冲液：由20mMTris-Acetate(pH7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
链霉素标记的亲和磁珠(购于GEhealthcareBioscienceAB)。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司；
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司；
四种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-RadS1000PCR仪，BeckmanMicrofuge22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGENPyroMarkQ96ID测序仪。
(1)提取石蜡活检组织标本DNA，步骤如下：
a.取组织DNA，加入组织裂解液、蛋白酶K，56℃温浴2小时；
b.将裂解液转入DNA吸附柱中，12000转离心1分钟；
c.加入500uL漂洗液1，12000转离心30秒；
d.加入500uL漂洗液2，12000转离心30秒；
e.将DNA吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，加入50uL去离子水，12000转离心1分钟，得到基因组DNA。
(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板，利用EGFR特异性引物进行PCR扩增；
其中，所述的PCR扩增体系为：10×PCRbuffer5μL，SEQIDNO：10.3μL，SEQIDNO：20.3μL，SEQIDNO：33μL，基因组DNA3μl，dNTPs0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，TaqDNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；
PCR扩增条件为：94℃5min；60个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与链霉素标记的亲和磁珠结合进行单链纯化：
在使用前，保证所有溶液都达到室温；
A.在PSQ96板中加入45μl退火缓冲液，然后每孔加入SEQIDNO：4测序引物(10uM)1uL；
B.使用Vertex混匀链霉素标记的亲和磁珠，将需要使用的链霉素标记的亲和磁珠总量(每样本3μL)转移到一个离心管中，在链霉素标记的亲和磁珠中加入结合缓冲液，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
C.将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得链霉素标记的亲和磁珠与生物素结合；
D.在真空负压纯化工作站中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、漂洗液和120ml变性缓冲液；
E.打开真空负压纯化工作站的泵，将纯化吸头在高纯水中清洗30秒,然后将纯化吸头移到PCR板中，抓取链霉素标记的亲和磁珠，将纯化吸头放入70％乙醇中5秒，然后移到变性缓冲液中5秒，再移到漂洗液中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将纯化吸头放入含有测序引物的板中，摇动，释放链霉素标记的亲和磁珠；
F.使用高纯水清洗纯化吸头。
G.将放有样品的PSQ96板放在干燥箱中加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果读取基因型频率。
从图1中可以看出，BRAFV600E(T>A)突变的标本检测结果。从测序图中可以看出T碱基突变为A碱基，结果判读直观。图2中，BRAFV600E(T>A)未发生突变的标本检测结果。从测序图中可以T碱基没有突变为A碱基，结果判读直观。

Claims (6)

1.一种检测BRAF基因V600E微量突变的引物，其特征在于，包括如下引物序列：
(1)扩增BRAF基因包含第600位密码子的引物对：上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
(2)阻滞引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
(3)测序引物：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
其中，引物SEQIDNO：2在5’末端进行生物素标记。
以上引物在一次检验中共同使用。
2.权利要求1所述的BRAF基因V600E微量突变的引物在制备检测BRAF基因V600E微量突变的试剂中的应用。
3.一种检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂；
(2)反应液：PCRBuffer，引物SEQIDNO：1～310μmol/L，MgCl22mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶2U/μL；
(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP，SEQIDNO：4所示测序引物10μmol/L。
4.权利要求3所述的检测BRAF基因V600E微量突变试剂盒的试剂盒在利用焦磷酸测序法检测BRAF基因V600E微量突变中的应用。
5.一种利用焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)提取标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，SEQIDNO：1～2所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增BRAF基因包含第600位密码子的片段；
(3)将步骤(2)得到的BRAF基因包含第600位密码子的片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序得到基因突变频率。
6.根据权利要求5所述的利用焦磷酸测序技术检测BRAF基因V600E微量突变的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增，
其PCR体系为50μL：10×PCR缓冲液5μL，SEQIDNO：10.3μL，SEQIDNO：20.3μL，SEQIDNO：33μL，基因组DNA3μl，dNTPs0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，TaqDNA聚合酶2U，加无菌水至50μL；
其PCR条件为：94℃5min；94℃40s，60℃40s，72℃40s，60个循环；72℃3min。
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