CN105164280A - 使用阻断性寡核苷酸进行dna扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括对怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品运行PCR扩增，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个预定靶突变位点处不同；其中所述方法利用了阻断性寡核苷酸，其除了所述靶突变位点外部的至少一个错配之外，与包含所述靶突变位点的所述参比DNA序列的一部分互补。

Description

使用阻断性寡核苷酸进行DNA扩增的方法
技术领域
本发明涉及核酸样品中变体靶序列例如突变的扩增、富集和/或检测的改进。
背景技术
在遗传分析中通常遇到的情形引起对在大大过量的非变体序列(“参比序列”)存在下鉴定低百分率的变体DNA序列(“靶序列”)的需要。作为实例，在过量的正常等位基因中灵敏可信地检测痕量的与疾病相关的突变等位基因，对于早期或确认诊断、治疗决定、疾病监测和预后分层来说已变得必不可少。然而，使用的高灵敏度与可靠性和实用性的平衡仍然具有挑战性。
Sanger测序这种鲁棒的标准方法只能在正常等位基因背景中检测约10-20％的突变等位基因，而其他更灵敏的基于PCR的测定法例如限制性片段长度多态性、扩增受阻突变系统PCR(ARMS-PCR)、变性高效液相色谱和实时PCR可能更加受限。扩增受阻突变系统PCR这种最广泛使用的方法是一种将PCR引物设计成在相差单个核苷酸残基的模板之间做出鉴别的扩增策略。这种方法简单省时，但是是序列特异性的，需要事先知道突变才能检测，并且有时产生严重的假阳性结果。
为了开发旨在克服现有技术方法的固有缺点的新的分子技术，已进行许多尝试。对于能够非破坏性选择和富集突变等位基因的PCR阶段的革新特别有兴趣，因为这可以提高下游测定法例如标准的测序分析的灵敏度和可信度。这些最新的富集PCR技术包括由肽核酸(PNA)(Sun等，2002)或锁核酸(LNA)(Dominguez等，2005)介导的PCR箝位(PCRclamping)，以及在较低变性温度下共扩增PCR(Li等，2008)。每种技术在成本、可用性或富集效率方面具有其自身的长处和限制。
在Lee等，2011中，作者描述了一种简单实用的富集技术，被称为使用3’-修饰寡核苷酸的突变富集(MEMO)。这种技术的概念与PNA/LNA介导的PCR箝位的概念相似，但PNA或LNA被3’-修饰的寡核苷酸代替，其廉价得多并容易设计。简单来说，两条通用引物和一条阻断引物构成PCR反应混合物。在阻断引物的3’-末端上，附连有抑制延伸的化合物例如C3间隔物、C6胺或磷酸酯，使得PCR不能通过阻断引物延伸DNA。阻断引物涵盖靶突变位点并与野生型序列互补。两条通用引物之一在靶突变位点附近与阻断引物重叠几个碱基，并因此与阻断引物竞争。阻断引物被设计成与它所竞争的通用引物相比具有更高的解链温度并以更高浓度使用在反应混合物中，它的DNA结合主要针对野生型序列，而它对突变序列的亲和性由于错配而显著降低。阻断引物失去竞争力使得能够通过通用引物对选择性扩增突变序列。
这种MEMO-PCR被用于鉴定甲状腺结节中罕见的3bpBRAF基因缺失(Jang等，2012)。
然而，对于具有提高的特异性的检测方法仍存在需求，特别是当变体靶序列带有核苷酸替换时。事实上，这样的序列到目前为止辨别不良。
发明概述
现在，本发明提供了一种特别是但不限于在过量的非变体或野生型(WT)序列(“参比序列”)存在下检测变体DNA序列(“靶序列”)的改进的方法。
本发明的方法是一种用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括对怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品运行PCR扩增，所述靶DNA序列与所述参比DNA序列在至少一个预定靶突变位点处不同；其中所述方法利用了阻断性寡核苷酸，其除了所述靶突变位点外部的至少一个错配之外，与包含所述靶突变位点的一部分所述参比DNA序列互补。
更具体来说，本发明提供了一种用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括：
a.提供怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个靶突变位点处不同；
b.添加以下物质以便形成反应混合物：
i)正向引物寡核苷酸和反向引物寡核苷酸，其与所述靶突变位点周围的一部分所述参比DNA序列完全互补，
ii)阻断性寡核苷酸，其被设计成与所述引物寡核苷酸之一竞争，并被修饰以使其不能被聚合酶延伸；
c.通过聚合酶链反应(PCR)对所述反应混合物进行扩增，由此延伸所述引物寡核苷酸以便选择性扩增所述靶DNA序列；
其中所述方法的特征在于所述阻断性寡核苷酸与包含所述靶突变位点的所述参比DNA序列的一部分互补，但是在所述靶突变位点的外部包含至少一个与所述参比DNA序列的错配。
所述靶突变可能包含一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失或一个或几个核苷酸的插入。最优选地，它是或包含单个核苷酸替换。
所述方法是已知的PCR箝位方法的改进。
根据本发明，已发现在所述阻断性寡核苷酸中添加序列错配显著提高了所述靶序列检测的特异性。特别是，序列错配的添加极大提高了以核苷酸替换为特征的变体序列的鉴别。
本发明的方法对于包含靶序列的核酸样品与包含参比序列的核酸样品的鉴别特别有用，例如用于诊断目的。
本发明还提供了一种用于在核酸样品中检测和/或确定靶突变的方法，所述方法包括对怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品进行本文中所描述的扩增方法，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个靶突变位点处不同，以及检测和/或确定已被扩增的靶DNA序列的所述靶突变。
因此，所述方法可以包括通过使用选自下列的一种或多种方法确定已被扩增的靶DNA序列的靶突变：MALDI-TOF、高分辨率熔解(HR熔解)、双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、第二代高通量测序、单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、变性高效液相色谱(dHPLC)、数字PCR、ARMS-PCR和定量PCR。
附图简述
图1是使用含有序列错配的3’修饰的寡核苷酸阻断物的本发明方法的示意图。在野生型序列存在下，寡核苷酸阻断物(1)杂交它的靶序列，引起PCR扩增抑制。在任何序列变异存在下，竞争引物(2)优选地结合于靶序列，引起变体序列的特异性扩增，这可以例如通过来自于水解探针(3)的荧光发射来监测。
图2示出了IDH1R132突变的序列和位置。在IDH1基因的野生型序列中下划线的是在变体序列中可以被其他核苷酸替换的两个核苷酸(在R132密码子内)。对于每个变体序列来说，相应的被替换的核苷酸用粗体示出。
详细描述
定义
当在本文中使用时，术语“扩增”靶序列是指增加靶序列的量。术语“选择性扩增”意味着仅仅(或基本上仅仅)扩增靶序列。术语“富集”更具体来说意味着提高样品中靶序列相对于相应的参比序列的比例。例如，当样品中靶序列与参比序列的比例一开始为5％比95％时，靶序列可能在扩增反应中被优选地扩增，以便产生70％靶序列比30％参比序列的比例。因此，靶序列相对于参比序列可能存在14倍的富集。
当在本文中使用时，术语“靶序列”是指待检测和扩增的目标序列。靶序列与对应的参比序列通常至少50％同源，优选地至少60％同源，优选地至少70％同源，但是必须与参比序列相差至少1个核苷酸。靶序列可以使用与用于参比序列的相同的引物对而通过PCR扩增。在特定实施方式中，核酸样品中靶序列的普遍性低于相应的参比序列。靶序列优选地占样品中参比序列+靶序列的总量的少于50％。靶序列可能是突变等位基因。例如，样品(例如血样)可能含有大量正常细胞和很少癌细胞。正常细胞含有非突变的或野生型等位基因，而少量癌细胞含有体细胞突变。在这种情况下，突变体是靶序列，而野生型序列是参比序列。
当在本文中使用时，术语“参比序列”意味着可以使用与用于靶序列的相同的引物对扩增，但是其扩增是不想要的。这样的序列涵盖了非变体或野生型序列。优选地，“参比序列”完全或至少部分已知。在特定实施方式中，术语“参比序列”是指核酸样品中比相应的靶序列更普遍的核酸。参比序列优选地占样品中参比序列+靶序列总量的超过50％。优选地，参比序列在RNA和/或DNA水平上表现为超过靶序列10X、15X、20X、25X、30X、35X、40X、45X、50X、60X、70X、80X、90X100X、150X、200X或更多。
当在本文中使用时，术语“野生型”是指在群体中对于某个基因来说最常见的多核苷酸序列或等位基因。一般来说，野生型等位基因从正常细胞获得。
当在本文中使用时，术语“靶突变”是指核酸序列中的核苷酸变化(即单个或多个核苷酸替换、缺失或插入)。带有突变的核酸具有在序列上与相应的野生型多核苷酸序列不同的核酸序列(突变等位基因)。本发明广泛涉及体细胞突变和多态性。本发明的方法在选择性扩增或富集在1至10个核苷酸位置处含有变化的突变等位基因中特别有用，尽管即使具有更大数量的序列变化时也是有用的。突变等位基因通常从患病组织或细胞获得，并且与疾病状态相关。术语“靶突变位点”意味着包含或怀疑或可能包含靶突变的DNA序列区域。尽管靶突变本身的本质或准确位置可能是未知的，但靶突变位点是确定或预定的。一般来说，它是包含靶突变的约5至约30个核苷酸的区域。在特定实施方式中，突变可能是单个核苷酸替换，其准确位置是已知的，因此靶突变位点可能是突变的核苷酸本身的位置。
当在本文中使用时，术语“解链温度”或“Tm”是指多核苷酸从其互补序列解离时的温度。一般来说，Tm可以被定义为双链核酸分子中一半的Watson-Crick碱基对被打断或解离(即被“解链”)而另一半Watson-Crick碱基对保持完整处于双链构象时的温度。换句话说，Tm被定义为两个互补序列的50％的核苷酸被退火(双链)并且50％的核苷酸变性(单链)时的温度。因此，Tm定义了从双链向单链核酸分子的转变中(或相反，从单链向双链核酸分子的转变中)的中点。Tm可以通过许多方法来估算，例如按照Wetmur1991通过最近邻计算和通过商业化程序包括OligoTM引物设计和可以在因特网上获得的程序。或者，Tm可以通过实际实验来确定。例如，可以在解链曲线测定法中使用双链DNA结合或嵌入染料例如溴化乙锭或SYBR-green(MolecularProbes)来确定核酸的实际Tm。用于确定核酸的Tm的其他方法在本领域中是公知的。
当在本文中使用时，“同源性”是指两个聚合分子例如两个多核苷酸之间的亚单位序列相似性。适用于确定百分序列一致性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述在Altschul等，1997和Altschul等，1990中。用于执行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
核酸样品
当在本文中使用时，“样品”是指含有或推测含有目标核酸(靶和/或参比序列)的任何物质，或其本身是含有或推测含有目标靶核酸的核酸。因此，术语“样品”包括核酸、细胞、生物体、组织、流体或物质的样品，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、粪便、皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外分泌物、唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养物组分的样品、天然分离物(例如饮用水、海水、固体材料)、微生物样本，以及已用核酸示踪剂分子“标记”的物体或样本。还涵盖福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。
靶(和参比序列)可以从各种不同来源获得，包括基因组DNA、互补DNA(cDNA)、病毒DNA、哺乳动物DNA、胎儿DNA或细菌DNA。在一种实施方式中，在本发明的方法中使用的核酸样品通常包含基因组DNA，例如具有靶和参比序列的基因组DNA。基因组DNA可以从血液、组织或细胞，按照公知的方法例如通过使用商品化试剂盒(例如Qiagen的QIAmpDNA提取试剂盒，用于从FFPE或血液提取)来分离。在另一种实施方式中，核酸来源可以是RNA，可以从其通过标准方法产生cDNA。
在特定实施方式中，本发明的方法的核酸样品包含以前在核酸扩增反应中扩增的靶和/或参比序列。本领域技术人员应该认识到，有许多方法可用于扩增核酸。
尽管一般来说参比序列是野生型等位基因并且靶序列是突变等位基因，但反过来也可能成立。突变等位基因可能包括任一个或多个核苷酸缺失、插入或改变。在某些实施方式中，突变等位基因是体细胞突变。
反应混合物
本发明的方法使用两条引物，其在PCR反应期间退火到靶和参比序列的相反链，以便形成扩增产物。扩增子的尺寸通常在约60至约500bp之间，优选为约80至约250bp。
引物寡核苷酸一般包含10至40个核苷酸，优选地10至30个核苷酸，优选地15至25个核苷酸。引物寡核苷酸优选地具有56-64℃左右的Tm。引物寡核苷酸与参比和靶序列的一部分100％互补。一般来说，所述引物在其3’或5’末端处不被修饰。
在本发明中，一条引物寡核苷酸是“竞争性”或“竞争”引物，即它意图与阻断性寡核苷酸竞争向参比或靶序列的结合。因此，正如下面解释的，竞争性引物至少部分地与阻断性寡核苷酸序列重叠。
当在本文中使用时，“阻断性寡核苷酸”是工程化改造的单链核酸序列。阻断性寡核苷酸可能是单链DNA、RNA、肽核酸或锁核酸之一。优选地，它是DNA寡核苷酸。阻断性寡核苷酸一般包含10至40个核苷酸，优选地15至30个核苷酸。
阻断性寡核苷酸被修饰，使得它不能被聚合酶延伸。
在优选实施方式中，阻断性寡核苷酸上的3’-末端被修饰，以抑制由聚合酶引起的延伸。
这样的阻断性序列可以通过任何已知方法来合成。首先，可以使用允许序列的3’-末端修饰的标准寡核苷酸合成方法通过直接合成来制造参比阻断性序列。3’-末端可能含有磷酸基团、氨基、双脱氧核苷酸或阻断5’到3’聚合酶延伸的任何其他组成部分。或者，可以在产生单链DNA作为终产物的PCR反应期间通过聚合酶合成来制造参比阻断性序列。
阻断性寡核苷酸的3’-末端的阻断可以以本领域技术人员公知的几种方式来实现。例如，可以利用在双脱氧核苷酸(ddNTP)存在下，在溶液中使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的反应，以向单链参比阻断性序列的末端添加单个ddNTP。ddNTP起到阻断聚合酶延伸的作用。或者，可以使用与阻断性序列的3’-末端互补的寡核苷酸模板来提供暂时的双链结构。然后可以使用聚合酶在与杂交的寡核苷酸相反的参比阻断性序列的3’-末端处插入单个ddNTP。
例如，阻断性寡核苷酸的3’-末端可能包含C3间隔物、C6胺或磷酸基团。
“C3间隔物”修饰向寡核苷酸的3’端添加三个碳的间隔物，其变成例如
C6胺修饰将胺官能团并入到寡核苷酸的3’端。
阻断性寡核苷酸被设计成与一条引物寡核苷酸竞争。
因此，阻断性寡核苷酸的序列与引物寡核苷酸之一的序列交叠。交叠(即竞争引物与阻断性寡核苷酸之间的共有序列)可以包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％的阻断性寡核苷酸或由其构成。或者交叠可以包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸或由其构成。所述交叠不包含靶突变位点。
阻断性寡核苷酸序列与它所竞争的引物寡核苷酸至少部分交叠，但是被设计成与它所竞争的引物寡核苷酸相比具有更高的解链温度(Tm)(例如高出约1至约15℃之间，优选地高出约1至约10℃之间)和/或以更高的浓度添加。
例如，阻断性寡核苷酸以比它所竞争的引物寡核苷酸的浓度高至少2倍、优选地至少3倍、至少4倍或至少5倍的浓度添加。
阻断性寡核苷酸与参比DNA序列的一部分互补，所述部分包含对应于靶突变位点的(非突变的或野生型)核苷酸。除了在靶突变位点处之外，参比DNA序列的所述部分与靶DNA序列的相应部分一致。
在优选实施方式中，阻断性寡核苷酸被设计成使得它的序列的中央部分结合参比或靶DNA序列的靶突变位点。
竞争性引物与阻断性寡核苷酸在靶突变位点附近交叠几个碱基。
根据本发明，阻断性寡核苷酸还包含至少一个不与参比或靶DNA序列上的相应核苷酸互补的核苷酸。当然应该理解，所述核苷酸不位于靶突变位点处。
不与参比或靶DNA序列上的相应核苷酸互补的核苷酸优选为A或T核苷酸而不是G或C核苷酸。
阻断性寡核苷酸中的这种错配(即所述核苷酸不与参比序列上的相应核苷酸互补)优选地位于靶突变位点的上游。
也是优选地，这个错配可能位于阻断性寡核苷酸的与竞争性引物交叠的部分中。
与竞争性引物的结合相比，阻断性寡核苷酸的结合偏向于参比(或野生型)序列。因此，不能发生参比序列的PCR延长。
在靶DNA序列中存在突变的情况下，阻断性寡核苷酸对突变或变体序列的亲和性由于所述错配而明显降低，并且存在竞争引物的偏好性结合，其允许PCR延长。因此，存在通过引物对的靶(突变或变体)序列的选择性扩增(参见图1)。
不通过任何机制相联系，本发明人相信这样的错配破坏阻断性寡核苷酸结合的稳定，这引起竞争性引物偏好性结合于靶序列，并因此引起靶序列的更多鉴别性扩增。
反应混合物通常包含其他成分，例如酶、碱基(例如A、T、G、C)或对执行扩增或检测有用的寡核苷酸。
具体来说，反应混合物可以包括核酸聚合物，它是催化核苷酸三磷酸聚合的酶。一般来说，所述酶在退火到靶序列的引物的3’-末端处启动合成，并沿着模板在5’方向上前进。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶和强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶。术语“核酸聚合酶”还涵盖RNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，则“核酸聚合酶”是指RNA依赖性聚合活性，例如反转录酶。
例如，所述反应混合物可能还含有核酸检测染料，例如荧光染料(例如DAPI、Hoechst染料、PicoGreen、RiboGreen、OliGreen和花青染料例如YO-YO、溴化乙锭和SybrGreen)。
在优选实施方式中，所述反应混合物可能还含有探针，优选为标记的探针。
有利情况下，探针不与引物或阻断性寡核苷酸交叠。
这对于定量PCR(qPCR)来说是特别有用的。
探针是与靶DNA上存在于正向(5’)和反向(3’)PCR引物结合位点之间的序列退火的寡核苷酸。探针的Tm一般高于引物的Tm。水解探针例如Taqman探针是特别有利的。这样的探针依赖于Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性，所述活性在PCR的延伸步骤期间降解杂交的不可延伸的DNA探针。这种探针被设计成杂交到扩增子内的区域，并用报告染料和淬灭染料双重标记。淬灭剂的近邻抑制报告染料的荧光。一旦Taq聚合酶的外切核酸酶活性降解探针后，报告物的荧光以与存在的模板量成正比的速率增加。
在优选实施方式中，探针可以用5’报告染料(例如FAM、6-羧基荧光素)和3’淬灭染料(例如TAMRA、6-羧基四甲基罗丹明)标记，只要两种染料近邻或附连于探针，所述淬灭染料即可淬灭报告染料的发射光谱。通过涉及在两个引物识别序列之间的位点处退火到靶模板的双标记的产荧光探针的聚合酶诱导的核裂解降解的过程，探针发出PCR扩增子形成的信号。参见例如美国专利号6,387,652。
扩增反应
本发明的扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行。
在其最简单形式中，PCR是使用杂交到靶DNA中的相反链并位于目标区域两侧的两条寡核苷酸引物酶法合成特定DNA序列的体外方法。包括模板变性、引物退火和由DNA聚合酶引起的退火引物的延伸的一系列重复的反应步骤，导致其末端由引物的5’末端定义的特定片段的指数性积累。
因此，本文中描述的PCR优选地重复2个或更多个循环，优选地10至50个循环。
PCR使用模板DNA(靶和参比序列)(至少1fg；更有用的情况下，1-1000ng)和至少7.5pmol寡核苷酸引物来进行。典型的反应混合物包括：5μlDNA，7.5pmol寡核苷酸引物，12.5μl来自于QuantiTect探针PCR试剂盒的2X主混合物和去离子水，至25μl的总体积。PCR使用可编程热循环仪来进行。
根据本发明，引物以约100至约500nM、优选地约300nM的浓度使用，而阻断性寡核苷酸以约1至约5μM、优选地约2μM的浓度使用。
PCR循环的每个步骤的长度和温度以及循环的数量，按照效果上的严紧性要求进行调整。退火温度和时间安排两者由预期引物退火到模板的效率和将要耐受的错配程度所决定。优化引物退火条件的严紧性的能力，完全在本领域技术人员的知识之内。使用30℃至72℃之间的退火温度。模板分子的初始变性通常在92℃至99℃之间进行约15秒，优选地进行约1或4分钟至约10-15分钟，然后对于简单PCR来说进行20-50个由变性(94-99℃15秒至1分钟)、退火(温度如上讨论的来确定，例如60℃；15s至2分钟)和延伸(72℃1分钟)构成的循环(在q-PCR中，延伸和退火在60℃步骤中同时进行1min)。任选的最终延伸步骤(在简单PCR中有用)一般在72℃进行约4分钟，并且可以跟随有无限的(0-24小时)在4℃的步骤。
本发明的扩增或富集程序在PCR装置例如热循环仪中，或者更优选地在实时反应条件下在实时PCR装置中进行。实时反应条件还利用核酸检测试剂(例如染料或探针)以便测量/检测产生的PCR产物。
方法的步骤一般重复多个循环以便获得靶和参比序列的足够扩增。在一种实施方式中，将方法的步骤重复5-40个循环，更优选地10-40个循环。循环的最适数量可以由本领域普通技术人员确定。优选地，本发明的方法在PCR装置中，更优选地在实时反映条件下在实时检测PCR装置例如Rotor-GeneQ5plexHRM机中进行。在这种实施方式中，反应混合物可以包括用于定量和/或检测反应的扩增产物的核酸检测试剂。
分析
靶序列的扩增可以跟随有被扩增序列的分析，例如精确确定靶序列的突变的方法。
一旦靶序列的扩增或富集完成后，可以因此对样品进行进一步处理，例如进行测序反应。
被扩增的等位基因可以通过本领域中已知的各种不同程序进一步处理，包括：MALDI-TOF，HR熔解，双脱氧测序，单分子测序，第二代高通量测序，焦磷酸测序，RFLP，数字PCR，ARMS-PCR和定量PCR。
这样的分析方法使得可以鉴定被扩增的靶序列的突变类型。
下面的实施例说明本发明但不限制其范围。
实施例：IDH1基因中突变的检测
本文描述的发明是一种用于选择性扩增在所选区域中含有核苷酸变异的DNA或cDNA靶序列的基于PCR的方法。反应混合物含有两个通用PCR引物(“竞争PCR引物”和“第二PCR引物”)和一个特异性阻断性寡核苷酸(“寡核苷酸阻断物”)。
本发明通过检测IDH1基因中的突变来说明。
在神经胶质瘤中和血液恶性肿瘤中已发现密码子132处的IDH1突变。由于突变和野生型序列相差仅仅一个核苷酸的替换(参见图2)，因此需要允许选择性辨别野生型和突变序列的特异性PCR方法。
材料
试验了对本发明的寡核苷酸阻断物(带有核苷酸错配)的不同设计(RVS_R132Blc_d5至RVS_R132Blc_d8，表1)，并与没有错配的相应寡核苷酸阻断物(RVS_R132Blc_d1至RVS_R132Blc_d4，表1)进行比较。所有寡核苷酸阻断物含有3’磷酸酯修饰。
表1：所试验的用于IDH1R132突变检测的不同寡核苷酸阻断物的序列和Tm。对于寡核苷酸阻断物RVS_R132Blc_d5至RVS_R132Blc_d8来说，错配的核苷酸被突出并用小写字母。对于每个寡核苷酸阻断物来说，变体位置被突出并下划线。
名称 序列5’3’ Tm(℃) SEQ ID NO:
RVS_R132Blc_d1 CCCCATAAGCATGACGACCTATGATGATA-P 66.2 SEQ ID NO:8
RVS_R132Blc_d2 CCCCATAAGCATGACGACCTATGATG-P 65.1 SEQ ID NO:9
RVS_R132Blc_d3 CCCATAAGCATGACGACCTATGATGA-P 63.8 SEQ ID NO:10
RVS_R132Blc_d4 CCCATAAGCATGACGACCTATGATG-P 62.4 SEQ ID NO:11
RVS_R132Blc_d5 CCCCATtAGCATGACGACCTATGATGATA-P 63.9 SEQ ID NO:12
RVS_R132Blc_d6 CCCCATtAGCATGACGACCTATGATG-P 62.8 SEQ ID NO:13
RVS_R132Blc_d7 CCCATtAGCATGACGACCTATGATGA-P 62.2 SEQ ID NO:14
RVS_R132Blc_d8 CCCATtAGCATGACGACCTATGATG-P 60.9 SEQ ID NO:15
竞争PCR引物、第二PCR引物和探针的序列提呈在下面的表中。探针在其5’末端处用荧光染料(FAM)标记并在其3’末端处用淬灭染料(TAMRA)标记。这些引物和探针以前从几种引物和探针设计中选择。
表2：竞争PCR引物、第二PCR引物和探针的序列和Tm。竞争PCR引物与寡核苷酸阻断物之间的共有序列被下划线。
PCR引物、寡核苷酸阻断物和探针的浓度在下面列出：
寡核苷酸 在反应中的浓度
寡核苷酸阻断物 2μM
PCR引物 300nM
探针 200nM
使用Quantitect探针PCR试剂盒(QIAGEN，参见：204345)进行扩增，qPCR反应在Rotor-GeneQ5plexHRM机(QIAGEN)上，使用下面的qPCR程序进行：
表3.qPCR程序
对于试验的每种寡核苷酸阻断物来说，将寡核苷酸阻断物与竞争PCR引物、第二PCR引物和探针混合。将所有这些混合物，在含有从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织(IDH1WT)提取的基因组DNA(gDNA)的样品上，在不存在或存在含有IDH1R132H或IDH1R132C突变的质粒的情况下进行试验。试验了三个样品：100％WT样品(对任何IDH1突变阴性)，突变水平为10％的IDH1R132H样品，和突变水平为30％的IDH1R132C样品。每个qPCR反应的基因组DNA(gDNA)输入量，对于25μl的最终PCR体积来说为25ng。
结果
1.使用本发明的寡核苷酸阻断物获得的性能，与没有错配的寡核苷酸 阻断物进行比较
下面的表示出了使用本发明的寡核苷酸阻断物获得的结果，并与没有错配的寡核苷酸阻断物进行比较。
表4：使用8种不同的寡核苷酸阻断物设计(四种含有错配，d5至d8，四种没有错配，d1至d4)在突变(R132C和R132H)和WT样品上获得的Ct(循环阈值)。
在WT样品上的最高Ct和对突变样品来说最低Ct的组合中获得了最佳结果。正如可以在表4中看到的，与没有错配的相应寡核苷酸阻断物相比，在寡核苷酸阻断物中添加核苷酸错配允许在突变样品上获得更低Ct值。例如，使用本发明的d7寡核苷酸阻断物对IDH1R132C突变体获得的Ct等于28.74，与此相比使用d3寡核苷酸阻断物时为40.73。因此，在寡核苷酸阻断物中添加核苷酸错配，允许更好地辨别WT和突变样品。
2.使用本发明的寡核苷酸阻断物的灵敏度试验结果
然后，使用d7寡核苷酸阻断物进行了检测极限(LoD；NCCLS指导纲要CLSIEP17-A2)确定研究。
使用以前描述的PCR箝位系统，试验了突变水平为20％、15％、10％、5％和2％的6种IDH1突变的连续稀释液。
所述分析方法是基于使用含有寡核苷酸阻断物的反应混合物获得的Ct(Ct突变体；仅扩增突变序列)与使用相同但不含寡核苷酸阻断物的反应混合物获得的Ct样品(Ct总；突变和WT序列被一起扩增)之间的ΔCt比较
ΔCt＝Ct突变体–Ct总
为6种IDH1突变的每种和5种突变水平的每种产生ΔCt数据(表5)，并且基于在CLSI/NCCLSEP17-A指导纲要中描述的“精密剖析方法”(precisionprofileapproach)确定LoD。如表5中所示，使用本发明的PCR方法，可以检测到低至2.23％的突变水平(取决于突变的类型)。
表5：6种IDH1突变的LOD概述
3.使用本发明的寡核苷酸阻断物获得的性能，与肽核酸(PNA)寡聚 物进行比较
执行PCR钳位以便检测变体序列的最常用方法使用PNA(肽核酸)寡聚物。PNA寡聚物具有与3’修饰的寡核苷酸阻断物相同的功能，但是由于更高的DNA亲和性，它们通常允许在WT与变体序列检测之间更好地辨别。
设计了4种PNA寡聚物(参见表6)。如前所述，将它们与竞争PCR引物、第二PCR引物和探针混合。所试验的样品是WT样品和R132H&R132C突变样品。
表6：PNA寡聚物的序列。
序列ID 5’3’序列
PNA_d1(SEQ ID NO:19) TCATAGGTCGTCATGCT
PNA_d2(SEQ ID NO:20) CATAGGTCGTCATG
PNA_d3(SEQ ID NO:21) ATAGGTCGTCATG
PNA_d4(SEQ ID NO:22) TAGGTCGTCAT
粗体的核苷酸示出了IDH1变体序列的位置。.
下面的表示出了使用4种PNA寡聚物和使用d7寡核苷酸阻断物在相同样品上获得的结果。
表7：使用PNA寡聚物(d1至d4)或d7寡核苷酸阻断物在WT和IDH1变体样品上获得的Ct结果。
在WT样品上的最高Ct与对于突变样品来说的最低Ct相关联的组合中获得了最佳结果。正如可以在表7中看到的，在PNA寡聚体中，d3PNA寡聚体是显示出最佳性能的寡聚体，允许最好地辨别WT和变体序列，并且d7寡核苷酸阻断物显示出与d3PNA寡聚体的性能可比的性能(参见下面的表8)。
表8：
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Claims (15)

1.一种用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括：
a.提供怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个靶突变位点处不同；
b.添加以下物质以便形成反应混合物：
i)正向引物寡核苷酸和反向引物寡核苷酸，其与所述靶突变位点周围的所述参比DNA序列的一部分完全互补，
ii)阻断性寡核苷酸，其被设计成与所述引物寡核苷酸之一竞争，并被修饰以使其不能被聚合酶延伸；
c.通过聚合酶链反应(PCR)对所述反应混合物进行扩增，由此延伸所述引物寡核苷酸以便选择性扩增所述靶DNA序列；
其中所述方法的特征在于所述阻断性寡核苷酸与包含所述靶突变位点的所述参比DNA序列的一部分互补，但是在所述靶突变位点的外部包含至少一个与所述参比DNA序列的错配。
2.权利要求1的方法，其中所述靶突变位点包含一个或几个核苷酸的替换、一个或几个核苷酸的缺失或一个或几个核苷酸的插入。
3.权利要求2的方法，其中所述靶突变位点包含单个核苷酸替换。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸中的所述错配位于所述靶突变位点的上游，即在5’区域中。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸的3’-末端被修饰以抑制由聚合酶引起的延伸。
6.权利要求5的方法，其中所述阻断性寡核苷酸上的3’-末端包含C3间隔物、C6胺或磷酸基团。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸是单链DNA、RNA、肽核酸或锁核酸之一。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中阻断性寡核苷酸序列被设计成与它所竞争的引物寡核苷酸相比具有更高的解链温度(Tm)和/或以更高的浓度添加。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸以与它所竞争的引物寡核苷酸的浓度相比高至少4或5倍的浓度添加。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述反应混合物还含有核酸检测染料。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述反应混合物还含有探针，优选为标记的探针。
12.权利要求11的方法，其中所述探针是水解探针。
13.权利要求10至12任一项的方法，其中所述PCR是定量PCR。
14.一种用于在核酸样品中检测和/或确定靶突变的方法，所述方法包括：对怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品进行权利要求1至13任一项的扩增方法，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个靶突变位点处不同；以及检测和/或确定已被扩增的靶DNA序列的所述靶突变。
15.权利要求14的方法，其包括通过使用选自下列的一种或多种方法确定所述已被扩增的靶DNA序列的所述靶突变：MALDI-TOF、HR熔解、双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、第二代高通量测序、SSCP、RFLP、dHPLC、数字PCR、ARMS-PCR和定量PCR。
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