JP2005000127A - 多型検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被検体における複数の多型部位を効率良く正確に判定することを可能にする。
【解決手段】多型の存在が既知である検出対象核酸の多型部位を含む領域の増幅産物に対して複数種のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって該検出対象核酸の多型の型を検出する多型検出方法であって、該複数種のプローブに対して相補的な6〜24塩基の複数種のオリゴマーを反応溶液中に共存させてハイブリダイゼーションさせることにより、検出結果の信頼性を高めることを特徴とする、上記多型検出方法を提供する。更にプローブに増幅産物の配列と非相補的な塩基を導入することにより、偽陽性を相対的に減らすことができる。
【選択図】 図4
【解決手段】多型の存在が既知である検出対象核酸の多型部位を含む領域の増幅産物に対して複数種のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって該検出対象核酸の多型の型を検出する多型検出方法であって、該複数種のプローブに対して相補的な6〜24塩基の複数種のオリゴマーを反応溶液中に共存させてハイブリダイゼーションさせることにより、検出結果の信頼性を高めることを特徴とする、上記多型検出方法を提供する。更にプローブに増幅産物の配列と非相補的な塩基を導入することにより、偽陽性を相対的に減らすことができる。
【選択図】 図4
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノム配列中に存在し、同種の個体間で異なる複数の多型部位を同時に検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ゲノムは生物の設計図であり、ヒトにおいては約30億塩基対のデオキシリボ核酸(DNA)から作られている。このゲノムの塩基配列中には、同種の個体間で異なる部位が複数発見されており、多型と呼ばれている。多型の中でも、特に一塩基のみが異なる多型は一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms: SNPs)と言われており、このSNPsの違いによって病気や薬の効き方に影響する場合があることから、こうした個人差を説明するものとして注目されている。
【0003】
個人差を生む原因として多型部位が発見されるに従い、被検体における複数の多型部位、特に複数のSNPsにおける一塩基の違いを同時に測定する必要が生まれてきた。DNAシーケンサを用いて直接配列を決定する方法もあるが、最近ではInvader法、TaqMan PCR法、MALDI−TOF法、DNAチップを用いた解析方法等が開発されている。特に簡便さや費用、解析に必要とする時間の短さなどから、フローサイトメーターの原理を応用したSAT(Suspension Array Technology)と呼ばれる技術が注目されている(例えば特許文献1参照)。SATとは、複数の染料の配合比率を変えた発光の異なる細胞大のマイクロビーズを用い、これらの複数のマイクロビーズを同じ溶液サンプル中で反応させた後、各マイクロビーズ表面の蛍光量を測定することにより、複数項目の同時測定を可能にした技術である。このSATを応用することで、ゲノム中に存在する複数箇所のSNPsにおける一塩基の違いを同時に測定することが可能になった。
【0004】
SATを応用した方法の中でも特に簡便で低コスト、短時間で行える方法としてDirect Hybridization法がある。Direct Hybridization法とは、検出対象核酸の多型部位を含む領域の相補鎖20塩基程度をプローブとし、1塩基以上の塩基配列の違いによって結合の有無を分ける方法である(例えば非特許文献1等参照)特にゲノムからの増幅産物とプローブとの結合を1塩基の違いによって判別できるため、この方法により、SNPsの型判定を行うことができる。
【0005】
【特許文献1】
特表2001−520323号公報
【非特許文献1】
Spiro Aら、「アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)」 (米国) 2000年10月 66巻、10号、p.4258−p.4265
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
図1は、Direct Hybridization法で多型部位の塩基が異なる2種のプローブに対して、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRによって増幅し、同時に標識も行った標識化PCR産物をハイブリダイズさせた時の模式図である。原理的には、図に示したように全てが相補的な配列の標識化PCR産物ならばハイブリダイズして陽性となり、1塩基でも異なる場合にはハイブリダイズせず陰性である。しかし図2に示すように、ストリンジェンシー条件によっては、1塩基が相補でなくても、その他の配列が相補的であるためにハイブリダイズしてしまい、本来は陰性となるべきものが偽陽性となってしまうことが実際には起きてしまうことがある。
この問題は、1種類のプローブのみでハイブリダイゼーションを行う場合、反応の時間や温度、バッファを最適化すること等により偽陽性を排除できる可能性が高い。
【0007】
しかしながら、SATを応用した方法で複数箇所を同時に測定する場合には、ハイブリダイゼーションの時間や温度、バッファ等は全て共通となるため、個々のプローブにあわせて最適化することはできない。従って、SATを応用した方法で偽陽性を排除するためには、ハイブリダイゼーションの時間や温度、バッファを最適化する以外の方法を用いなければならない。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために、新たな多型検出方法を開発した。
本発明者らが開発した多型検出方法は、プローブと増幅産物の塩基配列が相補的であるか、あるいは1塩基以上が相補的でないものであるかによって、プローブと標識された増幅産物とのハイブリダイゼーションの有無が決まり、そのハイブリダイゼーションの有無を測定して複数の多型を同時に検出する方法であって、プローブに対して相補鎖である短鎖のオリゴマーを反応溶液中に混入させてハイブリダイゼーションさせることにより、ハイブリダイゼーションの有無のシグナルを増幅させることを特徴とする。
【0009】
すなわち本発明は、以下の(1)〜(7)を提供する。
(1) 多型の存在が既知である検出対象核酸の多型部位を含む領域の増幅産物に対して複数種のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって該検出対象核酸の多型の型を検出する多型検出方法であって、該複数種のプローブに対して相補的な6〜24塩基の複数種のオリゴマーを反応溶液中に共存させてハイブリダイゼーションさせることにより、検出結果の信頼性を高めることを特徴とする、上記多型検出方法。
(2) 前記プローブと前記オリゴマーの組み合わせが、DNAプローブとDNAオリゴマー、DNAプローブとRNAオリゴマー、DNAプローブとPNAオリゴマー、RNAプローブとDNAオリゴマー、RNAプローブとRNAオリゴマー、RNAプローブとPNAオリゴマー、PNAプローブとDNAオリゴマー、PNAプローブとRNAオリゴマー、またはPNAプローブとPNAオリゴマーであることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(3) 前記プローブの塩基数が16〜24塩基であることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(4) 前記プローブの多型に対応する部位以外の配列中に増幅産物と相補的でない塩基を0〜4塩基導入することを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(5) 前記オリゴマーの塩基数が前記プローブの塩基数以下で6〜24塩基の範囲にあり、かつ多型部位がオリゴマーの中央付近となるように設計されていることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(6) 前記オリゴマーにプローブに対して相補的でない塩基を0〜6塩基導入することを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(7) 前記オリゴマーを、増幅産物に対して等モル以上加えることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
【0010】
本発明の方法を用いた検出の対象となる核酸は、特に限定するものではなく、哺乳動物等の動物及び植物、微生物由来の核酸であり、DNAであってもRNAであっても良い。本発明の方法は、予め多型の存在が知られている核酸を検出対象とし、その多型部位を含む領域の増幅産物に対して相補性を有するプローブを用いて行う。この場合、多型の種類に応じて2種以上のプローブを用意する。多型は、特に限定するものではないが、一塩基多型(SNP)であることが好ましい。
【0011】
前記プローブにおいて配列特異性を上げるためには、なるべく塩基数を多くしなくてはならず、逆に1塩基による違いをハイブリダイゼーションの有無に反映させるためには、なるべく塩基数を少なくしなくてはならない。1塩基による違いを効率良く検出するためには、プローブの塩基数としては16〜24塩基の範囲内であることが望ましい。
【0012】
上記したような「偽陽性」の割合を減らすためには、プローブの塩基数以下の塩基数の相補鎖であるオリゴマーを過剰量加えてハイブリダイゼーション反応中に存在させることが有効である。この場合、本来陰性であるべきプローブは、相補でない1塩基を有する標識された増幅産物と結合するよりも、相補鎖であるオリゴマーと結合する方が安定である。一方、陽性であるべきプローブは、鎖長が短いオリゴマーと結合するよりも、完全に相補的な増幅産物と結合する方が安定である。従って、増幅産物はオリゴマーの共存下では本来陰性となるべきプローブとは結合しにくく、陽性のプローブとは結合する。
【0013】
上記プローブとプローブに対して相補鎖であるオリゴマーとの組み合わせとしては、DNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、DNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、DNAプローブとPNA(Peptide Nucleic Acid 又はPolyamide Nucleic Acid)相補鎖オリゴマー、RNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、RNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、RNAプローブとPNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとPNA相補鎖オリゴマーをあげることができ、特に限定されるものではない。
【0014】
プローブに対して相補鎖であるオリゴマーの塩基数はプローブの塩基数以下で、6〜24塩基の範囲にあり、かつ多型部位が中央付近にくるように設計されていることが望ましい。中央付近とは、オリゴマーを構成する塩基配列における中央または中央から1若しくは2個外れた位置にある塩基の位置をいう。
【0015】
また、上記したような「偽陽性」の結果が得られる原因は、増幅産物の多型部位以外の領域と本来陰性であるべきプローブとの結合力が強いことにあるため、プローブにおける多型部位以外の配列中に増幅産物の塩基配列と相補でない塩基を0〜4塩基導入し、その結合力を落とすことで偽陽性をなくすことができる。
【0016】
さらにプローブに対して相補鎖であるオリゴマーは、プローブと完全に相補的な増幅産物とは交換反応が起きやすいことが望ましいため、そのオリゴマーにも変異を入れて結合力を落とすことで、陽性の割合を増やすことができる。プローブに対して相補鎖であるオリゴマーに入れる変異塩基数は、0〜6塩基が望ましく、0〜2塩基がさらに望ましい。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下に、図面を参照して本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではないことは勿論である。
【0018】
図1は、Direct Hybridization法で多型部位に対応して塩基が異なる2種のプローブ(1及び2)に対して、図の右側に示すようにゲノムの多型部位を含む領域をPCRによって増幅し、同時に標識も行った標識化PCR産物(標識された増幅産物)をハイブリダイズさせた時の模式図である。標識は、当分野で使用されている放射性・非放射性標識を適宜使用することができ、限定するものではないが、好ましくはフルオレセイン、Cy3、Cy5等の蛍光標識である。図に示したように、プローブに対して完全に相補的な配列を有する標識化PCR産物の場合にはハイブリダイズして陽性となり(プローブ2)、1塩基でも相補的でない塩基が存在する場合にはハイブリダイズせず陰性となる(プローブ1)のが理想的である。しかし、実際には、図2に示すように、1塩基のみが相補でなくても、その他の配列が相補的である場合には反応条件によってはハイブリダイズしてしまい、本来は陰性となるべきものが偽陽性となってしまうことがある(プローブ1)。
【0019】
前記プローブにおいて、配列のハイブリダイゼーション特異性を上げるためには、塩基長が長い方が好ましいが、逆に1塩基の違いをハイブリダイゼーションの有無に反映させるためには、なるべく塩基長を短くすることが好ましい。1塩基による違いを効率良く検出するためには、プローブの塩基数としては16〜24塩基の範囲内であることが好ましい。また、プローブはDNAやRNA、PNAであることが望ましい。
【0020】
偽陽性になってしまう原因は、多型部位以外の塩基配列同士の結合力が強いことにあるので、図3に示すようにプローブ中のその多型部位以外に対応する配列中に0〜4塩基の相補的でない塩基を導入し、その結合力を落とすことで偽陽性を減らすことができる。この場合、元々陽性であるプローブ2に対して変異を導入したプローブ4ではやはりハイブリダイズして陽性となるが、偽陽性であったプローブ1に対して非相補的な塩基を導入したプローブ3では結合力が低下することでハイブリダイズしなくなり、陰性の結果となる。
【0021】
一方、プローブに用いた配列を変化させることなく偽陽性を減らす方法として、図4に示すようにプローブの塩基数以下の塩基数を有する相補鎖オリゴマーを過剰量加えてハイブリダイゼーション反応中に存在させる手法があげられる。図4の左側に示したPCR反応の後、反応液中にオリゴマーを添加する。オリゴマーの塩基数はプローブの塩基数以下であり、好ましくは6〜24塩基、更に好ましくは8〜16塩基の範囲にあり、かつ多型部位が中央付近にくるように設計されていることが望ましい。この方法は、図5に示すように、標識された増幅産物の塩基配列と完全に相補的なオリゴマーとの結合が、1塩基だけ相補でない塩基配列を有するプローブとの結合よりも安定であり、かつ全塩基配列が相補的なプローブとの結合よりも不安定である原理より、偽陽性の割合を減らすことができ、この場合、オリゴマーは鎖長が短いため、陽性のプローブとの結合に影響する可能性は低い。
【0022】
さらに、プローブに対して相補鎖であるオリゴマーは、全配列が相補的で標識された増幅産物とは交換反応がより起きやすいことが望ましいため、図6や図7に示すように、そのオリゴマーにも変異を入れ、多型部位以外の領域における結合力を低下させることで、陽性の割合を増やすことができる。図6はオリゴマーの両端に相補的でない塩基を有する例であり、図7はオリゴマー配列の途中であって多型部位とは異なる部位に相補的でない塩基を有する例である。そのプローブに対して相補鎖であるオリゴマーに入れる変異塩基数は、0〜6塩基が望ましい。
添加するオリゴマーの量は、特に限定するものではないが、増幅産物に対して等モル以上加えることが好ましい。
【0023】
ハイブリダイゼーション反応の後、プローブとハイブリダイズした標識された増幅産物をその標識によって検出し、それによって多型の型を判別することができる。この場合、特に限定するものではないが、各プローブは、それぞれ識別可能なマイクロビーズやマイクロスフェアに結合させた状態で使用することができ、上記のハイブリダイゼーション反応によって標識された増幅産物と結合したプローブは、例えばLuminexシステム(Luminex Corporation)を用いたSATによって解析し、増幅産物と結合したプローブを同定することによって、同一または異なる被検体のサンプル中の複数の検出対象核酸の多型の型を同時に判別することができる。
【0024】
【発明の効果】
本発明によると、ゲノム配列中に存在する、同種の個体間で異なる複数の多型部位を同時に検出する場合に問題となる偽陽性を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】複数のプローブを用いて多型を検出する方法の模式図を示す。
【図2】複数のプローブを用いて多型を検出する方法における偽陽性と陽性の模式図を示す。
【図3】プローブに変異を入れて偽陽性を防ぐ方法の模式図を示す。
【図4】相補鎖であるオリゴマーを共存させて偽陽性を防ぐ方法の模式図を示す。
【図5】相補鎖であるオリゴマーを用いて偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
【図6】相補鎖であるオリゴマー配列の両端に変異を入れて効率良く偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
【図7】相補鎖であるオリゴマー配列の途中に変異を入れて効率良く偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノム配列中に存在し、同種の個体間で異なる複数の多型部位を同時に検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ゲノムは生物の設計図であり、ヒトにおいては約30億塩基対のデオキシリボ核酸(DNA)から作られている。このゲノムの塩基配列中には、同種の個体間で異なる部位が複数発見されており、多型と呼ばれている。多型の中でも、特に一塩基のみが異なる多型は一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms: SNPs)と言われており、このSNPsの違いによって病気や薬の効き方に影響する場合があることから、こうした個人差を説明するものとして注目されている。
【0003】
個人差を生む原因として多型部位が発見されるに従い、被検体における複数の多型部位、特に複数のSNPsにおける一塩基の違いを同時に測定する必要が生まれてきた。DNAシーケンサを用いて直接配列を決定する方法もあるが、最近ではInvader法、TaqMan PCR法、MALDI−TOF法、DNAチップを用いた解析方法等が開発されている。特に簡便さや費用、解析に必要とする時間の短さなどから、フローサイトメーターの原理を応用したSAT(Suspension Array Technology)と呼ばれる技術が注目されている(例えば特許文献1参照)。SATとは、複数の染料の配合比率を変えた発光の異なる細胞大のマイクロビーズを用い、これらの複数のマイクロビーズを同じ溶液サンプル中で反応させた後、各マイクロビーズ表面の蛍光量を測定することにより、複数項目の同時測定を可能にした技術である。このSATを応用することで、ゲノム中に存在する複数箇所のSNPsにおける一塩基の違いを同時に測定することが可能になった。
【0004】
SATを応用した方法の中でも特に簡便で低コスト、短時間で行える方法としてDirect Hybridization法がある。Direct Hybridization法とは、検出対象核酸の多型部位を含む領域の相補鎖20塩基程度をプローブとし、1塩基以上の塩基配列の違いによって結合の有無を分ける方法である(例えば非特許文献1等参照)特にゲノムからの増幅産物とプローブとの結合を1塩基の違いによって判別できるため、この方法により、SNPsの型判定を行うことができる。
【0005】
【特許文献1】
特表2001−520323号公報
【非特許文献1】
Spiro Aら、「アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)」 (米国) 2000年10月 66巻、10号、p.4258−p.4265
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
図1は、Direct Hybridization法で多型部位の塩基が異なる2種のプローブに対して、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRによって増幅し、同時に標識も行った標識化PCR産物をハイブリダイズさせた時の模式図である。原理的には、図に示したように全てが相補的な配列の標識化PCR産物ならばハイブリダイズして陽性となり、1塩基でも異なる場合にはハイブリダイズせず陰性である。しかし図2に示すように、ストリンジェンシー条件によっては、1塩基が相補でなくても、その他の配列が相補的であるためにハイブリダイズしてしまい、本来は陰性となるべきものが偽陽性となってしまうことが実際には起きてしまうことがある。
この問題は、1種類のプローブのみでハイブリダイゼーションを行う場合、反応の時間や温度、バッファを最適化すること等により偽陽性を排除できる可能性が高い。
【0007】
しかしながら、SATを応用した方法で複数箇所を同時に測定する場合には、ハイブリダイゼーションの時間や温度、バッファ等は全て共通となるため、個々のプローブにあわせて最適化することはできない。従って、SATを応用した方法で偽陽性を排除するためには、ハイブリダイゼーションの時間や温度、バッファを最適化する以外の方法を用いなければならない。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために、新たな多型検出方法を開発した。
本発明者らが開発した多型検出方法は、プローブと増幅産物の塩基配列が相補的であるか、あるいは1塩基以上が相補的でないものであるかによって、プローブと標識された増幅産物とのハイブリダイゼーションの有無が決まり、そのハイブリダイゼーションの有無を測定して複数の多型を同時に検出する方法であって、プローブに対して相補鎖である短鎖のオリゴマーを反応溶液中に混入させてハイブリダイゼーションさせることにより、ハイブリダイゼーションの有無のシグナルを増幅させることを特徴とする。
【0009】
すなわち本発明は、以下の(1)〜(7)を提供する。
(1) 多型の存在が既知である検出対象核酸の多型部位を含む領域の増幅産物に対して複数種のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって該検出対象核酸の多型の型を検出する多型検出方法であって、該複数種のプローブに対して相補的な6〜24塩基の複数種のオリゴマーを反応溶液中に共存させてハイブリダイゼーションさせることにより、検出結果の信頼性を高めることを特徴とする、上記多型検出方法。
(2) 前記プローブと前記オリゴマーの組み合わせが、DNAプローブとDNAオリゴマー、DNAプローブとRNAオリゴマー、DNAプローブとPNAオリゴマー、RNAプローブとDNAオリゴマー、RNAプローブとRNAオリゴマー、RNAプローブとPNAオリゴマー、PNAプローブとDNAオリゴマー、PNAプローブとRNAオリゴマー、またはPNAプローブとPNAオリゴマーであることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(3) 前記プローブの塩基数が16〜24塩基であることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(4) 前記プローブの多型に対応する部位以外の配列中に増幅産物と相補的でない塩基を0〜4塩基導入することを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(5) 前記オリゴマーの塩基数が前記プローブの塩基数以下で6〜24塩基の範囲にあり、かつ多型部位がオリゴマーの中央付近となるように設計されていることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(6) 前記オリゴマーにプローブに対して相補的でない塩基を0〜6塩基導入することを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
(7) 前記オリゴマーを、増幅産物に対して等モル以上加えることを特徴とする、上記(1)に記載の多型検出方法。
【0010】
本発明の方法を用いた検出の対象となる核酸は、特に限定するものではなく、哺乳動物等の動物及び植物、微生物由来の核酸であり、DNAであってもRNAであっても良い。本発明の方法は、予め多型の存在が知られている核酸を検出対象とし、その多型部位を含む領域の増幅産物に対して相補性を有するプローブを用いて行う。この場合、多型の種類に応じて2種以上のプローブを用意する。多型は、特に限定するものではないが、一塩基多型(SNP)であることが好ましい。
【0011】
前記プローブにおいて配列特異性を上げるためには、なるべく塩基数を多くしなくてはならず、逆に1塩基による違いをハイブリダイゼーションの有無に反映させるためには、なるべく塩基数を少なくしなくてはならない。1塩基による違いを効率良く検出するためには、プローブの塩基数としては16〜24塩基の範囲内であることが望ましい。
【0012】
上記したような「偽陽性」の割合を減らすためには、プローブの塩基数以下の塩基数の相補鎖であるオリゴマーを過剰量加えてハイブリダイゼーション反応中に存在させることが有効である。この場合、本来陰性であるべきプローブは、相補でない1塩基を有する標識された増幅産物と結合するよりも、相補鎖であるオリゴマーと結合する方が安定である。一方、陽性であるべきプローブは、鎖長が短いオリゴマーと結合するよりも、完全に相補的な増幅産物と結合する方が安定である。従って、増幅産物はオリゴマーの共存下では本来陰性となるべきプローブとは結合しにくく、陽性のプローブとは結合する。
【0013】
上記プローブとプローブに対して相補鎖であるオリゴマーとの組み合わせとしては、DNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、DNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、DNAプローブとPNA(Peptide Nucleic Acid 又はPolyamide Nucleic Acid)相補鎖オリゴマー、RNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、RNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、RNAプローブとPNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとDNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとRNA相補鎖オリゴマー、PNAプローブとPNA相補鎖オリゴマーをあげることができ、特に限定されるものではない。
【0014】
プローブに対して相補鎖であるオリゴマーの塩基数はプローブの塩基数以下で、6〜24塩基の範囲にあり、かつ多型部位が中央付近にくるように設計されていることが望ましい。中央付近とは、オリゴマーを構成する塩基配列における中央または中央から1若しくは2個外れた位置にある塩基の位置をいう。
【0015】
また、上記したような「偽陽性」の結果が得られる原因は、増幅産物の多型部位以外の領域と本来陰性であるべきプローブとの結合力が強いことにあるため、プローブにおける多型部位以外の配列中に増幅産物の塩基配列と相補でない塩基を0〜4塩基導入し、その結合力を落とすことで偽陽性をなくすことができる。
【0016】
さらにプローブに対して相補鎖であるオリゴマーは、プローブと完全に相補的な増幅産物とは交換反応が起きやすいことが望ましいため、そのオリゴマーにも変異を入れて結合力を落とすことで、陽性の割合を増やすことができる。プローブに対して相補鎖であるオリゴマーに入れる変異塩基数は、0〜6塩基が望ましく、0〜2塩基がさらに望ましい。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下に、図面を参照して本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではないことは勿論である。
【0018】
図1は、Direct Hybridization法で多型部位に対応して塩基が異なる2種のプローブ(1及び2)に対して、図の右側に示すようにゲノムの多型部位を含む領域をPCRによって増幅し、同時に標識も行った標識化PCR産物(標識された増幅産物)をハイブリダイズさせた時の模式図である。標識は、当分野で使用されている放射性・非放射性標識を適宜使用することができ、限定するものではないが、好ましくはフルオレセイン、Cy3、Cy5等の蛍光標識である。図に示したように、プローブに対して完全に相補的な配列を有する標識化PCR産物の場合にはハイブリダイズして陽性となり(プローブ2)、1塩基でも相補的でない塩基が存在する場合にはハイブリダイズせず陰性となる(プローブ1)のが理想的である。しかし、実際には、図2に示すように、1塩基のみが相補でなくても、その他の配列が相補的である場合には反応条件によってはハイブリダイズしてしまい、本来は陰性となるべきものが偽陽性となってしまうことがある(プローブ1)。
【0019】
前記プローブにおいて、配列のハイブリダイゼーション特異性を上げるためには、塩基長が長い方が好ましいが、逆に1塩基の違いをハイブリダイゼーションの有無に反映させるためには、なるべく塩基長を短くすることが好ましい。1塩基による違いを効率良く検出するためには、プローブの塩基数としては16〜24塩基の範囲内であることが好ましい。また、プローブはDNAやRNA、PNAであることが望ましい。
【0020】
偽陽性になってしまう原因は、多型部位以外の塩基配列同士の結合力が強いことにあるので、図3に示すようにプローブ中のその多型部位以外に対応する配列中に0〜4塩基の相補的でない塩基を導入し、その結合力を落とすことで偽陽性を減らすことができる。この場合、元々陽性であるプローブ2に対して変異を導入したプローブ4ではやはりハイブリダイズして陽性となるが、偽陽性であったプローブ1に対して非相補的な塩基を導入したプローブ3では結合力が低下することでハイブリダイズしなくなり、陰性の結果となる。
【0021】
一方、プローブに用いた配列を変化させることなく偽陽性を減らす方法として、図4に示すようにプローブの塩基数以下の塩基数を有する相補鎖オリゴマーを過剰量加えてハイブリダイゼーション反応中に存在させる手法があげられる。図4の左側に示したPCR反応の後、反応液中にオリゴマーを添加する。オリゴマーの塩基数はプローブの塩基数以下であり、好ましくは6〜24塩基、更に好ましくは8〜16塩基の範囲にあり、かつ多型部位が中央付近にくるように設計されていることが望ましい。この方法は、図5に示すように、標識された増幅産物の塩基配列と完全に相補的なオリゴマーとの結合が、1塩基だけ相補でない塩基配列を有するプローブとの結合よりも安定であり、かつ全塩基配列が相補的なプローブとの結合よりも不安定である原理より、偽陽性の割合を減らすことができ、この場合、オリゴマーは鎖長が短いため、陽性のプローブとの結合に影響する可能性は低い。
【0022】
さらに、プローブに対して相補鎖であるオリゴマーは、全配列が相補的で標識された増幅産物とは交換反応がより起きやすいことが望ましいため、図6や図7に示すように、そのオリゴマーにも変異を入れ、多型部位以外の領域における結合力を低下させることで、陽性の割合を増やすことができる。図6はオリゴマーの両端に相補的でない塩基を有する例であり、図7はオリゴマー配列の途中であって多型部位とは異なる部位に相補的でない塩基を有する例である。そのプローブに対して相補鎖であるオリゴマーに入れる変異塩基数は、0〜6塩基が望ましい。
添加するオリゴマーの量は、特に限定するものではないが、増幅産物に対して等モル以上加えることが好ましい。
【0023】
ハイブリダイゼーション反応の後、プローブとハイブリダイズした標識された増幅産物をその標識によって検出し、それによって多型の型を判別することができる。この場合、特に限定するものではないが、各プローブは、それぞれ識別可能なマイクロビーズやマイクロスフェアに結合させた状態で使用することができ、上記のハイブリダイゼーション反応によって標識された増幅産物と結合したプローブは、例えばLuminexシステム(Luminex Corporation)を用いたSATによって解析し、増幅産物と結合したプローブを同定することによって、同一または異なる被検体のサンプル中の複数の検出対象核酸の多型の型を同時に判別することができる。
【0024】
【発明の効果】
本発明によると、ゲノム配列中に存在する、同種の個体間で異なる複数の多型部位を同時に検出する場合に問題となる偽陽性を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】複数のプローブを用いて多型を検出する方法の模式図を示す。
【図2】複数のプローブを用いて多型を検出する方法における偽陽性と陽性の模式図を示す。
【図3】プローブに変異を入れて偽陽性を防ぐ方法の模式図を示す。
【図4】相補鎖であるオリゴマーを共存させて偽陽性を防ぐ方法の模式図を示す。
【図5】相補鎖であるオリゴマーを用いて偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
【図6】相補鎖であるオリゴマー配列の両端に変異を入れて効率良く偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
【図7】相補鎖であるオリゴマー配列の途中に変異を入れて効率良く偽陽性を防ぐ方法の原理図を示す。
Claims (7)
- 多型の存在が既知である検出対象核酸の多型部位を含む領域の増幅産物に対して複数種のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことによって該検出対象核酸の多型の型を検出する多型検出方法であって、該複数種のプローブに対して相補的な6〜24塩基の複数種のオリゴマーを反応溶液中に共存させてハイブリダイゼーションさせることにより、検出結果の信頼性を高めることを特徴とする、上記多型検出方法。
- 前記プローブと前記オリゴマーの組み合わせが、DNAプローブとDNAオリゴマー、DNAプローブとRNAオリゴマー、DNAプローブとPNAオリゴマー、RNAプローブとDNAオリゴマー、RNAプローブとRNAオリゴマー、RNAプローブとPNAオリゴマー、PNAプローブとDNAオリゴマー、PNAプローブとRNAオリゴマー、またはPNAプローブとPNAオリゴマーであることを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
- 前記プローブの塩基数が16〜24塩基であることを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
- 前記プローブの多型に対応する部位以外の配列中に増幅産物と相補的でない塩基を0〜4塩基導入することを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
- 前記オリゴマーの塩基数が前記プローブの塩基数以下で6〜24塩基の範囲にあり、かつ多型部位がオリゴマーの中央付近となるように設計されていることを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
- 前記オリゴマーにプローブに対して相補的でない塩基を0〜6塩基導入することを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
- 前記オリゴマーを、増幅産物に対して等モル以上加えることを特徴とする、請求項1に記載の多型検出方法。
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