CN106282165A - 一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用 - Google Patents

一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用，其扩增步骤包括植物预处理、植物样本总DNA提取、样本16S rRNA基因的扩增和基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析，样本16S rRNA基因的扩增包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析包括植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析。该基因扩增方法用于高通量测序的植物病害检测及植食性动物肠道微生物检测。本发明采用高通量测序技术进行植物内生细菌的测序分析，数据量更大，检测结果更完整，而且最大程度降低了植物宿主的污染，结果多样性更高，而且成本低。

Description

一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用
技术领域
本发明涉及基因扩增技术领域，具体是一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用。
背景技术
植物内生菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存的关系。植物内生菌可以产生活性物质作为生物纺织资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有着巨大的应用前景。虽然经过多年的研究，但目前植物内生细菌的研究还是处于初级阶段，对于植物内生细菌在植物中的分布及丰度调查还依赖于传统的分离纯化后使用通量较低的DGGE等方法，即使采用高通量测序进行的相关研究也因为植物宿主本身的质体和线粒体的干扰，造成植物内生细菌的研究始终处在基础研究的水平。
发明内容
本发明的目的在于克服植物内生细菌传统研究方法中需培养分离和植物宿主基因干扰等技术局限，提供一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，具体步骤如下：
(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4-6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；
(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；
(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；
31)16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增
①设计三对引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16SrRNA基因为模板，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429(F/R)引物对用于植物内生细菌16S rRNA基因的扩增；
②配置植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由乳液发生剂和PCR扩增缓冲液构成；
③将步骤②用于扩增植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温；
④向步骤③每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心4-6min，离心完成后取下层水相溶液为模板进行16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，结果检测通过吸取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物对的PCR产物作为阳性对照，回收目的条带；
32)16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增：以31)中的④步骤水相反应产物为模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR扩增缓冲液中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成，结果通过吸取该步骤反应产物5μL在琼脂糖凝胶电泳中检测；
(4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：包括植物内生细菌16SrRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析；
41)植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收
将步骤32)的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在280-300bp之间的目标条带，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5V/cm，20min；
42)扩增子测序文库构建
文库构建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit；
43)Illumina HiSeq测序
测序平台为Illumina HiSeq 2500，测序模式为V2SBS快速250PE模式；
44)测序数据生物信息学分析
测序得到的PE reads用FLASH软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列操作过程后完成数据过滤，得到供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，统计和作图使用R完成，操作步骤如下：
a、根据Barcode区分样品；
b、使用Uchime去除嵌合体；
c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTU的聚类；
d、挑选出OTU的代表性序列；
e、使用Greengene或Silva数据库进行物种分类信息的划分。
作为本发明进一步的方案：所述步骤31)的步骤②中，所述乳液发生剂由含有质量分数为94.9％矿物油、4.5％Span 80、0.5％吐温80、0.1％Triton X-100构成，所述PCR扩增缓冲液由0.4μM引物、2.5mM氯化镁、0.2mM dNTPs、1U Taq DNA聚合酶以及DNA模板组成。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤32)中的PCR扩增缓冲液由40mM Tris-HClpH8.0、40mM KCl、3mM MgCl2、5％甘油、1％吐温20、1mM dNTPs、1个单位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步骤④水相反应产物构成。
一种所述的植物内生菌16S rRNA基因扩增方法的应用，该基因扩增方法用于高通量测序的植物病害检测及植食性动物肠道微生物检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用高通量测序技术进行植物内生细菌的测序分析，相较于传统的DGGE等方法数据量更大，检测结果更完整；
2、本发明采用的植物内生菌测序技术最大程度降低了植物宿主的污染，对于植物内生细菌的研究带来了其他常规方法不能达到的精度和准确度；
3、本发明采用的植物内生细菌测序技术相较于目前采用roche 454测序平台进行的测序，结果显示本发明的结果多样性更高，成本低于roche454测序平台的十分之一。
附图说明
图1为植物内生细菌16S rRNA基因扩增结果示意图。
M：DNA分子量标记；C：对照扩增结果；R：植物内生细菌扩增结果。
图2为门水平植物内生细菌群落结构高通量测序结果示意图。
GSS：本发明植物内生细菌样本；C：对照植物内生细菌样本
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
植物内生菌16S rRNA基因扩增方法如下：
(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为75％的乙醇溶液浸泡30s，随后使用无菌水冲洗4遍彻底去除样本表面消毒剂；
(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；
(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；
31)16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增
①设计三对引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16SrRNA基因为模板，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429(F/R)引物对用于植物内生细菌16S rRNA基因的扩增；
②配置植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由乳液发生剂和PCR扩增缓冲液构成；乳液发生剂由含有质量分数为4.5％Span 80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的矿物油和余量蒸馏水混合而成；PCR扩增缓冲液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl2、5％甘油、1％吐温20、1mM dNTPs、1个单位的KOD DNA聚合酶、10μMAP1429-F、10μM AP1429-R、10μM MTR-F、10μM MTR-R、10μM CHP-F、10μM CHP-R和50-100纳克的样本总DNA混合而成；
③将步骤②用于扩增植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温；
④向步骤③每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心4-6min，离心完成后取下层水相溶液为模板进行16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，结果检测通过吸取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物对的PCR产物作为阳性对照，回收目的条带；
32)16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增：以31)中的④步骤水相反应产物为模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR扩增缓冲液中(PCR扩增缓冲液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl2、5％甘油、1％吐温20、1mM dNTPs、1个单位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步骤④水相反应产物构成)在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成，结果通过吸取该步骤反应产物5μL在琼脂糖凝胶电泳中检测；
(4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：包括植物内生细菌16SrRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析；
41)植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收
将步骤32)的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在280-300bp之间的目标条带，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5V/cm，20min；
42)扩增子测序文库构建
文库构建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit(FC-121-3001/3002)；
43)Illumina HiSeq测序
测序平台为Illumina HiSeq 2500，测序模式为V2SBS快速250PE模式；
44)测序数据生物信息学分析
测序得到的PE reads用FLASH软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列操作过程后完成数据过滤，得到供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，统计和作图使用R完成，操作步骤如下：
a、根据Barcode区分样品；
b、使用Uchime去除嵌合体；
c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTU的聚类；
d、挑选出OTU的代表性序列；
e、使用Greengene或Silva数据库进行物种分类信息的划分。
作为本发明进一步的方案：所述步骤31)的步骤②中，
实施例
采用CTAB法纯化椴树叶片总DNA，按照前述方法进行材料预处理，随后按照本发明的方法进行植物内生菌片段的扩增，同时以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物的样本做对照，扩增完毕后采用1％琼脂糖凝胶电泳对结果进行分离，结果如图1所示。在对照样本中扩增出的条带为线粒体与叶绿体条带，采用本发明后线粒体和叶绿体条带几乎不可见，仅有内生细菌条带清晰可见。
随后将植物内生细菌条带纯化回收后采用前述方法进行16S高变区二次扩增后建库测序。测序结果如图2所示，常规16S测序因为受到叶绿体同源基因的污染，测序结果95％以上均为非目的片段，而本发明将叶绿体污染降到最低，还原植物内生菌真实结构。
本发明采用了经过修饰的寡聚核苷酸引物组合，通过PCR方法抑制植物宿主来源的16S rRNA基因的扩增，与此同时植物内生细菌的16S rRNA基因的扩增不受影响，最终通过高通量测序的方法对植物内生菌的种类及丰度能够有一个详尽的调查和了解，对于植物内生细菌的鉴定提供了一个可靠的新途径。相对传统的分离纯化后鉴定的方法，本发明克服了已有的技术局限性。通过本发明可降低复杂操作过程中带来的环境污染，所需样本量极少，试验操作简便易行，可极大地提高植物内生细菌的鉴定水平。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (4)

1.一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)植物预处理：取植物样本0.5-1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4-6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，随后使用无菌水冲洗3-5遍彻底去除样本表面消毒剂；
(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；
(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；
31)16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增
①设计三对引物AP1429/F-R，MTR/F-R和CHP/F-R均以原核生物和植物16S rRNA基因为模板，其中MTR/F-R和CHP/F-R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429/F-R引物对用于植物内生细菌16SrRNA基因的扩增；
②配置植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由体积为1:1的乳液发生剂和PCR扩增缓冲液混合而成。
③将步骤②用于扩增植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mL PCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温；
④向步骤③每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200×g离心4-6min，离心完成后取下层水相溶液为模板进行16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，结果检测通过吸取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物对的PCR产物作为阳性对照，回收目的条带；
32)16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增：以31)中的④步骤水相反应产物为模板，使用引物U515F:5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和E806R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’在PCR扩增缓冲液中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成，结果通过吸取该步骤反应产物5μL在琼脂糖凝胶电泳中检测；
(4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：包括植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析；
41)植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收
将步骤32)的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在280-300bp之间的目标条带，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5V/cm，20min；
42)扩增子测序文库构建
文库构建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit；
43)Illumina HiSeq测序
测序平台为Illumina HiSeq 2500，测序模式为V2 SBS快速250PE模式；
44)测序数据生物信息学分析
测序得到的PE reads用FLASH软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列操作过程后完成数据过滤，得到供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，统计和作图使用R完成，操作步骤如下：
a、根据Barcode区分样品；
b、使用Uchime去除嵌合体；
c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTU的聚类；
d、挑选出OTU的代表性序列；
e、使用Greengene或Silva数据库进行物种分类信息的划分。
2.根据权利要求1所述的植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，其特征在于，所述步骤31)的步骤②中，所述乳液发生剂由含有质量分数为94.9％矿物油、4.5％Span 80、0.5％吐温80、0.1％Triton X-100构成，所述PCR扩增缓冲液由0.4μM引物、2.5mM氯化镁、0.2mMdNTPs、1U Taq DNA聚合酶以及DNA模板组成。
3.根据权利要求1所述的植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，其特征在于，所述步骤32)中的PCR扩增缓冲液由40mM Tris-HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl2、5％甘油、1％吐温20、1mM dNTPs、1个单位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步骤④水相反应产物构成。
4.一种如权利要求1所述的植物内生菌16S rRNA基因扩增方法的应用，其特征在于，该基因扩增方法用于高通量测序的植物病害检测及植食性动物肠道微生物检测。
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