CN111719014B

CN111719014B - 一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法

Info

Publication number: CN111719014B
Application number: CN202010707822.9A
Authority: CN
Inventors: 刘学端; 邹凯; 梁伊丽; 杨琴; 扶绍东
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111719014A

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法，该方法设计了以黄酮类物质代谢途径中4个关键功能基因(pal、4cl、chs、f3h)为基础的特异性通用引物，每个基因选取4个物种的序列作为模板，在相似度较高的单个外显子区域的保守区域内进行设计。将筛选到的内生菌进行基因组DNA提取，然后依次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱是否存在150‑250bp特异性片段来判断内生菌是否能够产黄酮。本发明利用基因的特异性引物对产黄酮内生菌进行简单、快速、准确的初步鉴定，为进一步的药物研究和开发提供了新的思路。

Description

一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法

技术领域

本发明属于细菌性能特征鉴定技术领域，涉及低成本、快速检测判断植物内生菌是否具有产黄酮能力的方法。

背景技术

黄酮类物质作为一种重要的中药成分，被广泛用于心脑血管疾病的治疗，其主要来源于银杏叶片的提取，产量较高，凭借普通的分光光度法和显色反应就能够实现准确的定量和定性分析。但是，银杏作为具有“活化石”美誉的保护植物，其现有植株的数量严重阻碍了心脑血管药物的开发和利用，所以尽快找到新的黄酮来源成为了该研究领域亟待解决的难题。西药的研究和开发模式为我们提供了思路，已有研究表明，部分产黄酮内生菌存在和植物体内极其相似的黄酮类物质代谢途径，从而微生物发酵生产中药前体物质和重要成分成为了可能。但是已有报道的微生物代谢产量远低于植物提取，从而导致先前用于植物提取检测的手段的适用性和灵敏性明显下降，检测可信度也随之较低。而后，学者们开始使用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)手段来进行检测，灵敏度和检测可信度大大提高，但是加大了样品处理和制备的难度，成本高，耗时长，干扰大，成为了新的缺点。为了实现快速准确，高效地检测是否具有产黄酮能力，本发明构建了一种低成本、快速鉴定产黄酮内生菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于通过设计以黄酮类物质代谢途径中4个关键功能基因(pal、4cl、chs、f3h)为基础的特异性通用引物，提供一种低成本、快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法，克服了传统检测方法的不足。

本发明是通过以下技术方案实现的：

每个基因选取多个物种的多条序列作为模板，在相似度较高的单个外显子区域的保守区域内进行设计。将筛选到的内生菌进行基因组DNA提取，然后依次进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图谱是否存在150-250bp特异性片段来判断内生菌是否能够产黄酮。本发明利用基因的特异性引物对产黄酮内生菌进行简单、快速、准确的初步鉴定。

具体步骤如下：

(1)基因序列查找：在NCBI基因库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索黄酮代谢途径中关键的苯丙氨酸转氨酶基因(pal)、4-香豆酸-辅酶A连接酶基因(4cl)、查尔酮合成酶基因(chs)和黄烷酮3羟化酶基因(f3h)共4个，每个基因选取4条来自不同物种的序列作为同源分析的模板，比对每个基因4条同源序列的外显子信息，选取合适的外显子序列；

(2)引物设计：分别对上述外显子序列进行同源性比对，在保守区域进行特异性引物设计并合成；

(3)内生菌基因组DNA的提取；

(4)PCR扩增和电泳分析：对内生菌的DNA样品进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，分析条带的特异性，结合测序推断内生菌是否具有产黄酮的能力。

步骤(1)中所使用的作为同源分析模板的苯丙氨酸转氨酶基因的GeneID为26804051、34443904、4990844、7912474，4-香豆酸-辅酶A连接酶基因的Gene ID为7911515、4982926、3510690、26803416，查尔酮合成酶基因的Gene ID为26807749、7918111、34450662、4981042，黄烷酮3-羟化酶基因的Gene ID为7917607、26804499、4986300、34445513，一共16条基因序列；见序列表SEQ ID NO.1-16。

步骤(1)中选用的引物设计模板是每个基因在不同物种中的4条同源序列中外显子长度较长，且片段大小相近的单个外显子序列。

步骤(2)中设计的引物的序列分别为：

pal

F5’-CGGAAATGCGCAACCAATCA-3’，见序列表SEQ ID NO.17；

R5’-TAAGCAGATGGAGTTGGGGC-3’，见序列表SEQ ID NO.18；

4cl

F5’-TGAGTCGGGATCGGGTGTTTGT-3’，见序列表SEQ ID NO.19；

R5’-CCGTTGTGCCGCTGGAATAGTT-3’，见序列表SEQ ID NO.20；

chs

F5’-GCTTGCGGACTGGAATGGTTCT-3’，见序列表SEQ ID NO.21；

R5’CGCTCTTCCTGGCTTCCCTTGA-3’，见序列表SEQ ID NO.22；

f3h

F5’TGTGAAAGGCGAGGACCATC-3’，见序列表SEQ ID NO.23；

R5’-CCGTAAGAGCAGTCAAGGCA-3’，见序列表SEQ ID NO.24。

步骤(3)内生菌收集：固体平板采用刮取法，液体摇瓶采用离心收菌法或取菌丝球法，液体培养收集时去除上清液并用无菌水洗涤3次。

步骤(3)内生菌基因组DNA的提取：对于真菌菌丝先进行液氮研磨成粉末后再使用试剂盒提取，细菌则直接采用试剂盒进行基因组提取。

步骤(4)中扩增的片段大小150-250bp。

步骤(4)PCR扩增出4条特异性条带，并且结合测序判断扩增出4个基因片段的内生菌具有产黄酮的能力。

本发明首次采用分子生物学的方法检测植物内生菌是否具有产黄酮的能力。该方法简便，快速，成本低廉，避免了现有技术样品处理和制备的难度大，成本高，耗时长，干扰大的缺点，且结果准确，可信度高。

附图说明

图1为实施例2中植物内生真菌基因组DNA电泳图；

图2实施例3中PCR产物电泳图；

图3实施例5的样品质谱检测总离子流图；

图4实施例5样品的MRM代谢物检测多峰图。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

引物的设计和合成

在NCBI基因库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索黄酮代谢途径中关键的苯丙氨酸转氨酶基因(pal)、4-香豆酸-辅酶A连接酶基因(4cl)、查尔酮合成酶基因(chs)和黄烷酮3羟化酶基因(f3h)共4个。每个基因选取4条来自不同物种的序列作为同源分析的模板，共16条序列(pal的GeneID为26804051、34443904、4990844、7912474，4cl的GeneID为7911515、4982926、3510690、26803416，chs的GeneID为26807749、7918111、34450662、4981042，f3h的Gene ID为7917607、26804499、4986300、34445513，16条序列见序列表SEQID NO.1-16)，手动比对每个基因4条同源序列的外显子长短和位置信息，选取所有外显子中长度较长且片段大小相近的序列，每个Gene ID所选取的具体外显子序列见序列表。

在DNAMAN软件中分别对上述外显子序列进行同源性比对，在保守区域进行特异性引物设计并合成，扩增片段大小限制为150-250bp，设计引物序列如下，交于上海生工生物有限公司进行引物合成：

pal

F5’-CGGAAATGCGCAACCAATCA-3’

R5’-TAAGCAGATGGAGTTGGGGC-3’

4cl

F5’-TGAGTCGGGATCGGGTGTTTGT-3’

R5’-CCGTTGTGCCGCTGGAATAGTT-3’

chs

F5’-GCTTGCGGACTGGAATGGTTCT-3’

R5’-CGCTCTTCCTGGCTTCCCTTGA-3’

f3h

F5’-TGTGAAAGGCGAGGACCATC-3’

R5’-CCGTAAGAGCAGTCAAGGCA-3’。

上述引物依次见序列表SEQ ID NO.17-24。

实施例2

一株植物内生真菌的基因组DNA提取

将分离纯化完放在4℃保藏的内生真菌斜面放在在室温下活化24小时，用灭菌后的接种针挑取部分菌丝和孢子接种到准备好的马丁氏固体培养基(磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂20g，水1000ml，pH自然，1％孟加拉红溶液3ml，1％链霉素液3ml)平板上，30℃恒温培养3天，用无菌接种铲刮取菌丝体约100mg，在液氮中研磨成粉末，并立即使用Omega Bio-TEK公司的E.Z.N.A.

HP Fungal DNA Kit进行基因组DNA提取，所有参数为试剂盒默认参数，将提取完的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶浓度0.8％，电压4V/cm，结果如图1所示，平行点样3次。

实施例3

采用实施例1的引物对实施例2中内生真菌基因组DNA PCR扩增和纯化

对于每一对引物，均采用下列反应体系进行PCR扩增：1倍Taq酶缓冲液(10MmTris-HCl[pH＝9.9]；1.5Mm MgCl₂；50Mm KCl以及0.1％TritonX-100)；20Mm dNTPs；100pMol正反引物，50ng模板DNA。PCR反应条件为如下：

将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶，4V/cm的条件下进行电泳，电泳结果如图2所示，特异性的PCR产物意味着潜在的产黄酮能力。把扩增的条带用切胶刀片从凝胶中切割下来，使用Omega Bio-TEK公司的E.Z.N.A.

Gel Extraction Kit试剂盒进行DNA回收和纯化，具体操作请参照说明书。

实施例4

PCR产物测序和分析

将回收的PCR样品进行测序，测序结果分别如下所示，

>pal

见SEQ ID NO.25；

>4cl

见SEQ ID NO.26；

>chs

见SEQ ID NO.27；

>f3h

见SEQ ID NO.28；

4对引物扩增的片段大小分别为178bp，192bp，227bp，234bp，符合预期设计目标。将序列放在NCBI库中进行比对，相似度很高地匹配到曲霉属Aspergillus下对应的pal，4cl，chs，f3h基因，这也与先前已经完成ITS鉴定的属于Aspergillus flavus的结果相符合。

实施例5

基于HPLC-MS的黄酮类物质靶向代谢组检测分析验证产黄酮能力

按照实施例2中的步骤进行真菌的培养和菌丝体的收集，然后进行如下处理步骤：

(1)真空冷冻干燥；

(2)利用研磨仪(MM 400，Retsch)研磨(30Hz，1.5分钟)至粉末状；

(3)称取100mg的粉末，溶解于1.0mL提取液(70％的甲醇水溶液)中；

(4)溶解后的样品4℃冰箱过夜，期间涡旋三次，提高提取率；

(5)离心(转速10，000g，10分钟)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm pore size)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。

色谱质谱采集条件：

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Ultra Performance LiquidChromatography，UPLC)(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，http：//www.shimadzu.com.cn/)和串联质谱(Tandem mass spectrometry，MS/MS)(AppliedBiosystems4500QTRAP，http：//www.appliedbiosystems.com.cn/)。

液相条件主要包括：

(1)色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C181.8μm，2.1mm*100mm；

(2)流动相：水相为超纯水(加入0.04％的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04％的乙酸)；

(3)洗脱梯度：0min水/乙腈(95∶5 V/V)，11.0min为5∶95 V/V，12.0min为5∶95 V/V，12.1min为95∶5 V/V，15.0min为95∶5 V/V；

(4)流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量5μL。

质谱条件主要包括：

(1)电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度550℃；

(2)质谱电压5500V；

(3)帘气(curtain gas，CUR)25psi；

(4)碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)高；

(5)去簇电压(declustering potential，DP)具体优化；

(6)碰撞能(collision energy，CE)具体优化(Chen et al.2013)。

检测结果、分析

样品质谱检测的离子流图如图3，基于代谢数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图中多反应监测模式MRM代谢物检测多峰图(图4)展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。本实验中所检测到的部分代谢物的代谢物编号、积分数值以及对应代谢物名称等信息见表1。结果表明，该真菌能够产生多种黄酮类代谢物及其衍生物。

表1黄酮类物质靶向代谢组检测结果

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgtcgatat cagcatggcc tcatacatgg cagagttggc ttatctggcc aacccagtga 60

gctcgcacgt acaagcagcg gaaatgcgca accaatcaat caactccatg gcttttgtat 120

caagtcggta caccatgcaa gcagtcgaaa tagtgtcgct catgtgcgct tgtagtctgt 180

acattggatg ccaggccctg gatctccgag tactacattt gacctacctc gataacgtca 240

aaccccaact ccatctgctt acatcggatc tcttctcctc atacctatca gactcagagc 300

ttgcaaatct gaccgaatcc ctatgggaaa atatcgcaaa aagctggtcg acaacaactc 360

gtcagggtat acctgagcga gtgcaagcag ccgttaaaga cgttattcct acactactag 420

atattctgaa agagaagcgc ggcccaggcc tttcggatct gaatcgatgg gaaacccaag 480

ctgccgccct tctcaacaag acgtaccagg atacggcaga cgcattcttc aatcagcaaa 540

ataccgaaga gttcttgggc gctggtgcta agattcttta ccgcactgtt cgccgagatc 600

tcaacgttcc tttccacttg ggcttcgtgg agcacccgac agctaacaat gataccctca 660

acggtcgctc gaaaaagacc attggatctt ggatatcaat catctatgag gctattcgcg 720

acggcagctt aatgggtcct tttatggaat ctcttgcttc aaaaagctct agtgcggatg 780

actctttgac aaagataaga agtctacgga tgtcccgact ttaa 824

<210> 2

<211> 1960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatgcactc cctgcgtcga taacggatga tacagatgtg ttggatcgaa tgcaccacag 60

cgtagatgta ctaggccaaa aactagccaa tggcgaagtc atatatggtg tgaacacagg 120

attcggagga agcgcagata cccgaaccca ggactatgga acactgcaga aggcactgat 180

tcagcatcac aatgctgcgg ttctactccc gagcgatcgc ggccttgcaa gtcctgtctc 240

tagcttagag cacttgaaga gccattgcat gcccgttccg ctagttcgag cagctatgct 300

cacgcgttgc aattcactct tacgaggcca ttccgccgtt cgggtccagg ttgtcgaaca 360

tattctcact ctacttgctc atgggttgac cccagtggta ccactacgcg gcagcatatc 420

ggcttctgga gacctgaccc ctctagccta tatcgcgggc gcattggagg gtaatccgga 480

tatctcaatg cataacgctg ctggcgatca gatcatacct gctgatcaag cactacaaga 540

ggcaggactc gtaccattgg acttcggtcc caaggagggc ctgggcctcc taaacggcac 600

tgctttcagt ggcggcgcag ctagcctcgt tctcttcgaa gcgaatcagc ttgttctact 660

ttcccaggta ctcacagcca tgggcaccga ggctttactt ggcaccagat acaactacca 720

tccattcata gccgatgccc ggccccatga cggacaacga gaagcggcag ccaacatctt 780

caagatgttg accgactcta agttggcaaa gaatcctact gaaggcagtg agaccgccaa 840

ccatggcggg ttggcacagg atcggtacgc cctgcgaaca tcgacccaat ggatcggacc 900

ccagatagag aatatggcat tgtccttgaa acaggttgtc accgaactca actccacaac 960

ggacaacccg ctcctggatc cagaggaggc ccagatccat catggaggca acttccaggc 1020

agcatcggtc acgtcttcga tggaaaagac aatgagtgcg atgcagatgt tgggcaagat 1080

gatcttttcc cagtgttccg aaattatcaa tccgaccttg agtcggggtc ttcctcccaa 1140

tctcagtgtc gacgatccca gtttatcctt tgcgttcaag ggggtggaca tcaatatggc 1200

gtcgtacatg tctgagctag cctatctgaa ccatcctgtc agcaaccatg ttcagtcggc 1260

ggagatgcac aatcagggtc taaattcgtt ggccttcatt gcttgtcgct atgctgcaga 1320

tgccgtggaa gttctgtcgc tgatgaccgc cacatacctg tacgtactct gccaggcact 1380

tgatctgcgg gcacttcatt tggaattcgt gaatgatgca cgggtccagg tcgacgagat 1440

tacagctgag ctttattcat caacgtttgg tgctcgttta ccggcagtga aagtccaact 1500

ctgggaagaa ttgatgaatc actgggcacg aacgagcact tgtgatctca cagaacgatg 1560

ccagctaacc gcaagttgct ctattggagt tctcctaaac tccttggcag cagagagtag 1620

tccggccaac actgcgctga ccggctttca atcagcccag gattggcaaa cccgagtatg 1680

ccatgtccta gcacgaagct atgtagcaac gcgagagacc tttctcaaga accagacgac 1740

caagtcatat ctctgcagtg cgtcacgcag tttctacgtc tttgtccggg agaaacttgc 1800

cgtgccaata caccgaggta tcgccgatca cccgacctat aattcgacgg agcgtcgcaa 1860

aaaggaatgt attggaacac agattagcaa ggtgtacacc gctcttcgaa agggtgaatt 1920

ccaagatgtc ctgctgagtt gttggcaaga tcgtcgttga 1960

<210> 3

<211> 1865

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgtcaatac cggatttgga ggaagtgctg actcacgaac gaaccaaacg accactttgc 60

agagctccct ccttcagcta ctccaaagcg gcattcttac cgcatctgat actaccaatg 120

aaggcttaca gctcaatctc caagggcaga gctcccactc catgccttct gaatgggtca 180

aggcaactat gcttgtgaga agcaattcag ttgctcgggg ccattcagca gtgtccctgc 240

ctgcaattag cgcaattttg cggttgattc gtgaggatat cgtccctgta attcctctgc 300

ggggaactat ttccgcgtct ggggatctca tgccgctcgc atacgttgtt ggggctattg 360

aaggaagtcc cgggatttat gtgcgcgtca aggacggatc ggagcatcaa gttgtcacgg 420

ctcaaaaggc actacagaca attggtgcta aaggagtcac gctgggaccc aaggagggcc 480

ttggtttggt caacggcaca gccgcttcgg gtgctcttgc cggcttagtg ctctatgagg 540

cgcatcagct ggccgtactt gcgcaggcag tcactgctct gacagtagag gccatacaag 600

ggagcacaga aagttttcat ccttttatcg cccaggtgcg cccgcatgaa ggccagattg 660

aagctgcgga gaacattcta tctctcctga aaggctccct acttgcgaga ggaagtagta 720

ccacccaaac taggacgggc ctcgtgcaag atcgttattc tctccgaaca gccagtcaat 780

ggattgggcc ccaactggaa gatcttcttc tcgcagatcg gcaagtccag gtcgagctca 840

attcgacgtc agataacccg cttattgata cgggctcgaa gaccttctac actggaggga 900

acttccaagc aacttcaatt acttctgcga tggagaagac tcgacttgcg ttgcaaatgt 960

tcgggaagat gttgtttgtt cagtgcaacg agatgataga ccccaatttg aacaatggtc 1020

tgcctaccaa tctagtcgcc gacgatccca gcctctcctt caccatgaag ggggtagata 1080

tcaacatggc ggcctacatg tctgagttag cgtatctcgc caacccagtt agctcccacg 1140

ttcagactgc agagatgcaa aaccaagcgc tcaactcact ggcatttgtt tcagcacggt 1200

atacgatgaa ggcggttgac atcgtgtcaa tgatgggtgc gtgtgcacta tacgttgctt 1260

gccaagccct cgacctgcgc gtcctgcagc ttcgcttttt ccaaagagtt cagggtgtcg 1320

ccaaagaaat tgcgcatgga gcttttggaa aagcgcttga accatttgag attgatcagg 1380

tagcggatca tctttccgaa gcgatccaga actcttggcc gtcaacttca cgccttgatc 1440

ttcgcgatcg ctgcaagcgc gtagccgaga tgttcatccc cgtccttttc ggggccctgt 1500

tacagataat cccacaaaat cggcagactt cagacctatt tacagcgata tctgcatgta 1560

agatgataag cgttttcaag ctcgaaggtg tttatcggga agtgtttgcc gaattttgca 1620

cttcgcaacc cactgccgac ttcctcggaa cagggacaaa ggagatttat acatttattc 1680

gacatgatct tcgagttcca ttccaccagg gctttgtcga acacccatca gcgagccaga 1740

ccgatttgcc agagacgatc aacggcagag tcaagaagac ggtggggggt tggatatcag 1800

ttgtctatga agcgttgcga aacgggacgc tgagtggcac aatccttaat tcttttcaac 1860

aatga 1865

<210> 4

<211> 1901

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttaatac tggctttggc ggcagtgcgg attctcgaac ggatcgagtg gtagcgctgc 60

aatccggact ctcccagctt ctacaagcag gtgtgctagt cgcctcagat aaggatacca 120

atgtggacct cgagcgacaa attcgcctgg attcacatgc tgtgcccgtt ccctgggtgc 180

gagcagccat gttggttcgg tgcaattcga acgcccgcgg ccactctgcg gttacgcttt 240

cagtgataaa gtctatcttg cagctcttgg agagtcacat cacaccagtt gttcctttac 300

gaggctctat ctccgcttct ggagatctca ttccactttc ttacattgca ggcgccattg 360

aaggcaatcc cgatgtatat gttcatgtac agaaatctca tagatctcag ataatatctt 420

ctagagatgc acttttgtct gccggcatgg aacctcaagt gctaggtcct aaggagggat 480

taggcctagt taacggcact tcattctctg cagcactgtc cagtctcgtt atgtacgagg 540

ctcatcaatt ggtcgtgctg gtgcaggcga tctcggctgt ggctctagaa gcactcatgg 600

gtaatgctga gagctttcac cccttcatct ctgccattcg gcctcatgac ggccaaatgg 660

aatgttccag gaatattctt tcatttctcc agggatctcg tcttgcccag ggtattcaaa 720

gtgtgaagac tcatactcgc caaggcttga tgcaggatag atatgcactt cgatgtgtgc 780

ctcagtggat cggaccacag ctggaagacc tcctgctcgc acataagcaa gtcaccgttg 840

aacttaactc aacaacagat aacccactga tagatcccga gaccggcgat attctccatg 900

gcggtaattt ccaagcggtt tccgttactt ctgcaatgga gaagacaaga tcatgccttc 960

agatgcttgg caggctcctc ttctctcagt ctactgaact ggtcgaccca agccttaaca 1020

acggcctccc taccaatctt gtcgccgatg acccaagcct ctccttcact atgaaaggcg 1080

tcgatattag catggcttca tacatggcag agttggctta ccttgccaac ccggtaagct 1140

cgcacgtaca agcagcggaa atgcgcaacc aatcaatcaa ctctatggct tttgtatcca 1200

gtcggtacac catgcaggca gtcgagatag tgtcgctcat gtgcgcttgt agtctataca 1260

ttggatgcca ggccttggat ctccgagtac tgcatttgac ctacctcgat aacatcaagc 1320

cccaactcca tctgcttacc tccgatcatt tctcctcata cctatcagac aaagagcttg 1380

aaactctgac cgaatcactc tgggaaaaca tctcaaaaag ctggtcgaca acaacccgcc 1440

aaggcatacc tgaacgagtg caagtagccg taaaaaacgc tattcctacg ctgctagata 1500

ctctgaaaga gaagcgcggt ccaggtcttt cggatctgaa tcgatgggaa acccaagccg 1560

ctgaccttct caacaaaaca tatcaaaaca cggcagacat attctttaac caacaaaaca 1620

ccgaggagtt cctgggcgct ggtgctaaga ttctctaccg caccgttcgc caagaactca 1680

atgttccctt ccacttgggc ttcgtggagc acccgacagt taataatgaa accttgaatg 1740

gtcgctcgaa aaagaccatt ggttcttgga tatcaattat ctatgaggcc attcgtgacg 1800

gcaggttaat gggtcctttc atggaatccc ttgcttcaaa gagctccagt gctgatgact 1860

ctttgacaaa gataaggagt ctaaggatgt cccgactttg a 1901

<210> 5

<211> 1061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcctttca aatcgcgttg gcaggtgcat gtcccggatg cgcacctggc aactgtcctg 60

ttcacatcgc ccactcatcc gttgtcaaag acgcacaggt gcttctctga ggcagctcgt 120

cctgatacgc attatttcac tacccatgac ttccgactat ggtcgaagcg ttttgcggcg 180

ggattgcgca aggctggtct ccagccgggc gatcgggtct tgctcttctc cggcaacgat 240

ctcttcttcc ctgttgtttt tatggggatc atcatggcgg gaggtatctt ctcgggggcc 300

aatcctacct atgtcgcaag ggaattggcg taccagctcc aggatagcgg cgcaacttac 360

ctcatttgcg ctgatgggag tcttgacact ggtattgaag cggcgcaggt agcaggactg 420

agtcgggatc gggtgtttgt ttttaacaat gccatctttg atgggcgtgg ggagggtaag 480

atgggttgtc gctactgggg tgaactggtg gcgtctgcgg aggaaggcag tcaatttgaa 540

tgggatgatc tatcgactcc ggagaaggct aaccgtactc tcgccttaaa ctattccagc 600

ggcacaacgg gaaggcccaa gggcgtggaa atctctcaca agaactattg cgccaacatg 660

cttcaggcga atcaatcgtt ttatctgaat ccggactgga aggcaagaaa tgctagggct 720

cggttcctct gtttcctgcc gatgtatcat gcgatggctc agaatatttt cattgcgaat 780

gcattaaagc gtgaggttcc tgtgtatatc atgcccaagt tcgacttcat caagatgctg 840

gaatatacgg agaaattccg catcacggac cttattctgg tacctcccgt ggtggttgcc 900

ctagccaagc atcctgcggt cagaagcggc aaatatgatc ttagcagtgt tgaggggatt 960

ggcagcggtg cagcgcccct gggaagagaa gtctgtgatg aagtggaggc gctctgggaa 1020

cctggacgtg tcaatgtgaa acagggctgg ggaatgaccg a 1061

<210> 6

<211> 1061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgccgttca agtcgcgctg gcagattgac atccccaaca cccatatggc ctcggctttg 60

ctgacttcgc cgactcaccc cctctccaag acgcaccgct gcttctccga ggctgctcgt 120

cccgacacac actacttcac ccctcacgtt ttccgtctat ggtgtcaacg atttgcagca 180

ggcttgcgca agcatggcct acagtcgggt gaccgtctac tactttactc cggcaatgac 240

ttattcttcc ccgtcgtctt tcttggcacc atcatggctg gcggcatctt caccggcgca 300

aacccatcct acgtcgctcg ggaactagcc tatcagttgc aggattccgg tgcaacctat 360

ctgatctgcg ccgaaggcag tctggacaca ggaatcgaag ccgcaggact ggctggcctc 420

aaccgcgatc gggtgtttgt ctttagtaat gccatatatg atggccaagg aggtgccgtc 480

aagggctgcc gctactgggg ggacctgata gcgtctgagg acgaaggtag cggattcgca 540

tgggatgact tgtccagcgc ggagttggcc gatcggactc tcgccttgaa ctactccagt 600

ggcaccactg gcagacccaa aggggtagag atcacgcaca agaactatgt tgccaacctc 660

agacagttca accacctctc ctacctcaat ccggattgga aggacaagca gactcgcacg 720

cgctggctct gtttccttcc catgtatcac gccatggcac agaacatctt catcgcgtcc 780

gccctaagtc gcgatatacc cgtgtatatc atgcccaagt ttgattttct caaagtcctc 840

gagtacacgg agaagttccg catcagcgat ctcatcctgg ttccaccggt ggcggtggca 900

ctggccaagc atcctgcagt cagaagcggc caatacgatt tgagtagcgt ggaaagcgta 960

tcctgcggcg cggcacctct agggagggag gtttgtgtgg aggtagaagc attgtgggaa 1020

cctggacgca tcaacgtcaa acagggatgg ggtatgaccg a 1061

<210> 7

<211> 1061

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgcccttcc attcacgcta tcacgtcgat atcccaaaca tccacctcgc ctcactcctt 60

ctcaagtcgc ccacgcaccc tctctcgtca acacatcgat gcttctccga agccgcccgc 120

ccaaacaccc attacttcac cacccatgac ttccgattgt ggagccagcg cttcgcggct 180

ggcctgcgca aagctgggct gcagcccggt gaccgcgtat tgctcttctc cgggaatgat 240

ctgttcttcc ctgttgtgtt catggggatc atcatggctg gcggaatttt cacgggtgcc 300

aatccgacgt ttgtggcgag agagctagct ttccagttgc aggatagcgg ggcttcgttc 360

ctcctttgtg cggacgtgag tctagatgtg ggcatcgagg ctgctcagat cgccgggttg 420

agccgggatc gggtgtttgt gttcaataat gcgatctttg atgggcaggg agaagggagg 480

aaagggtgcc gctactgggg ccagttggta gcttccgttg aggaggggag agagtttgtc 540

tgggatgagc tgtcgacgcc cgaggaagct gatcgaactc ttgcgctgaa ctactcgagc 600

ggcacgactg gccggccaaa gggggtagag attacgcaca agaactacgt tgccaacatg 660

ttgcagtaca actacatgtt ttacctgaac cctgactgga aggagaggtc ggccagggcg 720

cggtggttgt gctttttgcc gatgtaccat gctatggcgc agaacatttt tatcgcggct 780

gcgctgagcc gtgaagtgcc tgtctacatt atgcctaagt ttgacttcat caagatgctt 840

gaatatgtgg agaagttccg catctcggac ctcatcttgg tgccccctgt ggtggttgca 900

ttggccaagc accctgcggt caagagcgga aagtacgttc tgagcagcgt agagactatc 960

ggaagtggag cagcacccct gggacgagaa gtgtgcgagg aggttgaggc cctgtggcca 1020

ccgggtcgca ttaatgtcaa gcagggctgg ggaatgaccg a 1061

<210> 8

<211> 1031

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggaagtca gatctcgttg gaagattgaa gtccccaacg cccacctggc caccctggtc 60

ttcaaatccc ccactcaccc catctccaaa acaaagccat gtttcatcga cgccgcccga 120

cccgataccc attttctcac ccacgatgac ttccgacttt ggagccaacg ctttgcggtc 180

ggtctgcgta agtcgggcat caagaccggc gaccgaatcc tgtttttctc tggaaacaat 240

ctgttcttcc ccgtcgtgta catggggatt ctcatggccg gtggtgtttt caccggtgca 300

aacccggcgt acatcccacg ggagctggcc taccagttga aagacagcgg agcaacgtac 360

ctgatctgtg cggaaaagag catcgagacc ggtgtgcaag ccgccaagat ggcgggactc 420

ggcccccacc aggtctttct attcaatgac gcattctacg caacaaagga gccggtcgat 480

ttctccagcc cagactatcg gtattgggga gagttgatcg gggaggagga ggaaggccgg 540

cggttcgcct gggacgagct ctccaccgcg gaattggcca acaggacctt ggccttgaac 600

tactcgagcg gcaccacggg cgtcccaaag ggtgtggacc tgagtcacaa gaacatcatc 660

gccaatatct tgcagtacaa cttcctgttc tacctccaga acgaccaccg ggagcgcatc 720

gcgcggggga aatggctctg cctactgccc atgtaccacg cgatggcgca gaacatgttc 780

atgagcattg cgttgatgcg cggcgtgccc gtgtacatca tggacaagta tgattttgtt 840

aagtttttgc aggcgattga acggtttcgc atctctgacc tcaccttggt gccaccaatc 900

gttgtgtcca tggtgaagcg ccccgaaacc aaacagcacg atttgagcag cgtggaaacc 960

attttctgtg gggcggcgcc gcttggaagg gagatttccg agaaggcgga agcctgtggc 1020

cggagggaaa g 1031

<210> 9

<211> 641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctattgaag ttaattgaaa tcaacgagag gacgaaaatc gagaaccgct acagcatcct 60

accgacagac tatcccatat ggctccaaga ctacatcttg acgaactccg aatgtgatag 120

tatgttcaaa cagtatggca tcccgctagc aacactcgcg gcgacgcaag ccatcgcaga 180

ctggggcggc aatgcgatgg acatcaccca cgtggttgct atgacctgca caagtacgtc 240

cagccctgga ttcgactgca cactctgtca ggaactaggg ctcgccaaac atgttcgtcg 300

cacattggtg aatggggtca cttgcgctgg cagcgtggcg atgctgcgta cagcatacga 360

ccttctgctt ggcgcaacac aacaaggcaa gccggcccgt gctcttgtgg tcgccgctga 420

gacccagact gtttatatca agggttggtt ggacactgtt gcaagggatt caatacctaa 480

tcttgccccg accttgttcg gagatggtgc cggcgcactg gtactcagca atgggatcgg 540

tgtcaaggaa agtgaaagag aggctatatg gaatatccaa ggtgctcagt caacgcttct 600

ggatgaagca ggaaatatcg ggattcagtg cactcctaca g 641

<210> 10

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtacgaaag accctttacg ttaatgaaaa gtcaagaata caaactcgtc gtaccgctgt 60

gccgttcgac gaccccttct ggagtgaccc caagctacca gatatcgctg aatgtgatgt 120

cctgttcaga aaatatggtg tcccagtcgc agaagaggca gcgaggaaag cgcttgcgga 180

ctggaatggt tctttcaacg atcttactca tgttgtcgta gttacatgta caaacacagc 240

caacccagga ttagactaca tgatttgtga gagactaggt ctccgaaaaa atgtgcaacg 300

cactctcctc catggagttg gctgcgcagg gggtgccgct gctctacgga cggcaaatga 360

gcttcttctt ggggcggcct ttcaagggaa gccaggaaga gcgcttgttg ttgcatgcga 420

aatttgtatg atctttttcc gctcaatgct cgaagacatt gtcaaagccc aagaagcaaa 480

cgttgcaatg acccttttcg gtgatggtgc cggtgctatg gtgctgagca atgggatttg 540

ccctaaaacc tctgaacgag ctcctctctg gaatattctg aattgtcgca caaccctcct 600

cgaggattct gcttccagca tccagttcaa catccgcccg cacg 644

<210> 11

<211> 641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctactgaag ctgattgaga tcaacgagag aacgaaaatt gagaaccgct acagcgtcct 60

cccgatcgac tatcctatat ggctccagga ctacattctg tccaacacag aatgcgataa 120

tatgttcaaa cagtatggca tccccctagc aatactcgcg gccacgcaag ccatcgcaga 180

ctggggcggc aatccaatgg acatcaccca cgtggtggcg atgacctgca caagtacgtc 240

gagccctgga ttcgactgca cactctgcca ggaactcggg ctcgccaagc atgtccgccg 300

gacattgttg aatgggatca cttgcgctgg cagcgtagcg gcccttcgta cagcatacga 360

ccttctgctt ggtgcgacac aacaagggaa gccgggccgt gctcttgtga ttgctactga 420

gactcagact gtttatatca aaggttggtt ggacatcgtc gcaagggaat caatacccaa 480

tcttgccccg accttgttcg gagatggcgc cagcgcactg gtcctcagta acggggtcgg 540

tgtcaaggag agcgaaaggg agcctatatg gaatatccac ggcgctcaat caacgcttct 600

ggatgaagca ggcaatattg gaattcagtg tactcccaca g 641

<210> 12

<211> 1003

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctcaaagcc tttctcaaga ttaatgccca tacaggcatc gagaatcgag cagtcgtcga 60

cctgtgggac gacccccgct ggcacgggga gcttccaccc ccaacagaag aggtagactc 120

agggtttcgg gaatacagtg tccagctttc taaaaatgct gccctcaaag cccttcgtga 180

aagcaatatc gacccctccg cgatcacgca tatggtatcc gtgacggtaa cgaacggtgg 240

agccccgggt tttgatcagc ttgtcgctcg tgaattaggt ttatctccta cgacggagcg 300

aatcctactg agcggtgtcg gctgcgctgg cggatgcgca gctctccggg ttgcatccac 360

gctagcagct gcagccacat atcggaaaca agaagcgcga attctggttg tggcatgtga 420

gctgtgcagt attcatctca ggggggagct gcatgcggct tcactggctg agatgacaac 480

aattgccccg gccttgttta gtgacggtgc atccgcgttt gtcctctgca acccgttggg 540

aatgagcgat aagaccccca agcaattcgc agtcgttgat caaaggaccg gcgtcacacc 600

aggaaccctg gatgaaatgt cgtacaaagt gactacccat ggctttttgg ccacaatttc 660

caagagcatt cctaagcttg ctgttgcgtc tatacaagct ccttttcagt ccctgataca 720

atctaatggg atgtcctccg cttctccaac agactttcat tgggctcttc atccaggtgg 780

tcgggctgtt atccagggtg cacaggatgc ccttaacttg cccgatgacg cattagccgc 840

tagcaatgag atctatagaa caaggggtaa tacgtccagt gttgccgtcc ttgctgtgtt 900

ggataaggtg cgggagttga agctgccgac ttcgaatgtt attgcatgta gctttgggcc 960

tggtcttaca acggagatgg cccttttacg ccgcatggta tag 1003

<210> 13

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaatgccaca cggaagtagt agagaagctt ctccgtctgt tcgccattct ccttgaactt 60

ccagacgagg accaacttgt caaggaccat caatacgatg tgaaaggcga ggaccatctt 120

cggtacatgc actacgcagc ccgcggggcc gaagagaaca agatagtggg cggtatgtac 180

gtacctggac atacggatct ggggacagtc actctactct ttcgccaacc agttgcggca 240

ttgcaaatcc tcaattccca gggtcagtgg aaatgggtgc gtccacaaga tggaaccatc 300

acggtcaata cctgtgatgc cttgactgct cttacgggtg gtctaatcaa gtcaagcatt 360

catcgtgtac atgtgccacc agctgaccag gctcatgtgg atcgattagg agtattgtac 420

tttgcacg 428

<210> 14

<211> 425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaatgtcaca cagaggttgt cgagaagctt ctccgtctgt tcgccattct ccttgagctt 60

cctgaggacc aacttgtccg ggaccatcaa tatgatgtca aaggcgagga ccatcttcga 120

tatatgtact acgcagcacg cggggccgag gagaaccaaa aggtaggcag tatgtacgta 180

cccgggcata cagacttagg cactgtcact cttttgtttc gccaaccggt tgctgcattg 240

cagatcctta attctgaggg cgagtggaaa tgggtccgtc cgcaggatgg aacaattacg 300

gtcaacacct gtgatgcact gactgctctt acgggtggtc tgatcaagtc aagcattcat 360

cgcgtccatg tgccaccagc tgatcaagcg catgttgatc ggttgggagt attatacttt 420

gcacg 425

<210> 15

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaatgccaca ccgaggtagt cgaaaaactc ctccgcctct tcgccattct gcttgaactg 60

ccggacgaag accaactcgt ccgtgatcac cagtacgacg taaagggtga agatcacctc 120

cgatacatgc actacgcagc gcgtggagcc gaactcaaca agaaagtcgg gggtctatat 180

tctcccggtc ataccgatct gggcacggtg actctgctct tccgccaacc cgttgccgca 240

ctgcaaatcc tcaactcgga aggacagtgg aaatgggtcc gcccacagga tggaaccatc 300

actatcaata cctgtgatgc attgactgct ctcacgggcg gattgatcaa atcgagcatt 360

catcgggttc atgtgcctcc cgctgatcag gcgcatgtgg atcggttggg ggtgctttac 420

tttgccag 428

<210> 16

<211> 425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaatgtcaca aagaagttgt cgaaaagctt ctccgtctat ttgccattct cctggaactt 60

cctgaggacc aacttgtccg ggaccatcaa tatgatgtga aaggcgagga ccatcttcga 120

tacatgcact acgcagcacg cggcgccgag gagaacaaaa aagtgggcag tatgtacgtt 180

ccgggacata cagacctggg cacggtcact cttttgtttc gccaacccgt tgctgcattg 240

cagatcctta attctgaggg tcagtggaaa tgggttcgtc cacaggatgg aacaattacg 300

gtcaatacct gtgatgcgtt gactgctctt acgggtggtc tgattaagtc aagcatccat 360

cgcgtccatg tgccaccagc tgatcaagcg catgttgatc ggttgggagt attatacttt 420

gcacg 425

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cggaaatgcg caaccaatca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

taagcagatg gagttggggc 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgagtcggga tcgggtgttt gt 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccgttgtgcc gctggaatag tt 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcttgcggac tggaatggtt ct 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgctcttcct ggcttccctt ga 22

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtgaaaggc gaggaccatc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccgtaagagc agtcaaggca 20

<210> 25

<211> 178

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cggaaatgcg caaccaatca acctttggct tagtatccag tcggtacacc atgcaggcag 60

tcgagatagt gtcgctcatg tgcgcttgta gtctatacat tggatgccag gccttggatc 120

tccgagtact gcatttgacc tacctcgata acatcaagcc ccaactccat ctgcttaa 178

<210> 26

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgagtcggga tcgggtgttt gtgtacaaag gagctatgaa gctcgatcag ttcaggttca 60

gtaagggttg tcgcttactg gggtgaactg gtggcgtctg cggaggaagg cagtcaattt 120

gaatgggatg atctatcgac tccggagaag gctaaccgta ctctcgcctt aaactattcc 180

agcggcacaa cg 192

<210> 27

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcttgcggac tggaatggtt ctgtagcatc ttcctgttgt cgtagttaca tgtacgaata 60

cagccaatcc aggattagac tacatgattt gtgagagact aggtctccga aaaaatgtgc 120

aacgcactct cctgcatgga gttggctgcg cagggggtgc cgctgctcta cggacggcaa 180

atgaacttct tcttggggcg gcctttcaag ggaagcagga agagcga 227

<210> 28

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccgtaagagc agtcaaggca gcggtatgac gtgatggttc atcttgtgga cgcacccatt 60

tccactgacc ctgggaattg aggatttgca atgccgcaac tggttggcga aagagtaggg 120

tgactgtccc cagatccgta tggccaggta cgtacatacc gcccactatc ttgttctctt 180

cggccccgcg ggctgcgtag tgcatgtacc gaagatggtc ctcgcctttc acaa 234

Claims

1.一种快速鉴定植物产黄酮内生菌的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)基因序列查找：在NCBI基因库中搜索苯丙氨酸转氨酶基因、4-香豆酸-辅酶A连接酶基因、查尔酮合成酶基因和黄烷酮3-羟化酶基因，每个基因选取4条来自不同物种的序列作为同源分析的模板，比对每个基因4条同源序列的外显子信息，选取合适的外显子序列；

(3)内生菌基因组DNA的提取；

(4)PCR扩增和电泳分析：对内生菌的DNA样品进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，分析条带的特异性，结合测序推断内生菌是否具有产黄酮的能力；

步骤(2)中设计的引物序列分别为：

苯丙氨酸转氨酶基因：

F 5’-CGGAAATGCGCAACCAATCA-3’

R 5’-TAAGCAGATGGAGTTGGGGC-3’；

4-香豆酸-辅酶A连接酶基因：

F 5’-TGAGTCGGGATCGGGTGTTTGT-3’

R 5’-CCGTTGTGCCGCTGGAATAGTT-3’；

查尔酮合成酶基因：

F 5’-GCTTGCGGACTGGAATGGTTCT-3’

R 5’-CGCTCTTCCTGGCTTCCCTTGA-3’；

黄烷酮3-羟化酶基因

F 5’-TGTGAAAGGCGAGGACCATC-3’

R 5’-CCGTAAGAGCAGTCAAGGCA-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)内生菌收集：固体平板采用刮取法，液体摇瓶采用离心收菌法或取菌丝球法，液体培养收集时去除上清液并用无菌水洗涤3次。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)内生菌基因组DNA的提取：对于真菌菌丝先进行液氮研磨成粉末后再使用试剂盒提取，细菌则直接采用试剂盒进行基因组提取。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中扩增的片段大小150-250bp。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：步骤(4)PCR扩增出4条特异性条带，并且结合测序判断扩增出4个基因片段的内生菌具有产黄酮的能力。