CN115015462B

CN115015462B - 一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法

Info

Publication number: CN115015462B
Application number: CN202210773784.6A
Authority: CN
Inventors: 李怡杰; 娄兵海; 雷翠云; 武晓晓; 宋雅琴; 黄俊源
Original assignee: Guangxi Academy Of Specialty Crops
Current assignee: Guangxi Academy Of Specialty Crops
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-07-01
Also published as: CN115015462A

Abstract

本发明公开了一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，在提取柑橘叶片的化学成分后送入超高效液相色谱‑电喷雾‑四级杆飞行时间质谱分析，下机数据经过预处理后，利用主成分分析得分图、正交偏最小二乘法判别分析得分图等统计手段区分出健康植株和带病植株的差异。本发明首次将高分辨LCMS技术应用于柑橘黄龙病的非靶向分析，尤其适合黄龙病感染早期无症状阶段的诊断。相比现有技术的优点在于：对叶片代谢物进行无偏向分析，可大幅提高早期黄龙病侵染阶段的植株检出率，对田间采集到的无症状样品，检出率超过80％。

Description

一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法

【技术领域】

本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法。

【背景技术】

柑橘是世界上最重要的商品水果之一，我国是柑橘的主产国，柑橘产业在我国农村社会与经济中具有重要的地位和作用。黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害，中国的柑橘黄龙病主要由亚洲韧皮部杆菌侵染引起，该病菌可通过木虱传播。染病后植株会出现黄梢、树势衰弱、叶片斑驳黄化、生长缓慢、果实着色不均等现象，并最终死亡。黄龙病目前尚无治疗方法，也无完全耐抗品种，所以需要通过早诊断来尽早确定病树并移除，从而减少田间传染源，提高防控效果。但柑橘黄龙病发病存在6-12个月的潜伏期，且部分发病症状与缺素等症状相似，因此通过肉眼观察症状来确定黄龙病树往往造成误判，且耽误在第一时间移除病树，造成黄龙病的传播扩散，造成巨大经济损失。分子检测技术可克服这一缺陷，目前已有相关的研究，例如中国专利申请号201610965716.4公开了柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌双重检测试剂盒及其应用，设计了柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的双重数字PCR定量检测试剂组合物，该试剂盒包含：柑橘病样DNA提取试剂、数字PCR反应试剂、柑橘黄龙病和柑橘溃疡病阳性对照样品模板和阴性对照样品模板，应用该发明试剂盒检测柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌具有特异性强、抗杂质干扰更好、简便快速、检测灵敏度比现有的实时荧光定量PCR检测方法高约10倍等优点，可用于柑橘黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的早期定性、定量检测以及流行病学调查等。

针对柑橘黄龙病的检测，目前已有核酸杂交和血清学检测的方法，但都非常耗时和繁琐。普通PCR、实时荧光定量PCR也可用于此二种病害的检测，但普通PCR检测灵敏度不足，而实时荧光定量PCR方法在定量分析时，需要依赖标准物质和标准曲线，仅能实现相对定量分析；另外，实时荧光定量PCR对反应扩增效率要求很高，且易受柑橘样品DNA纯度和PCR抑制因子等因素的影响，导致对目标序列定量的不准确估计和对低含菌量病样的检测灵敏度不足。此外，基于实时荧光定量PCR的复合多靶标体系的优化非常困难，定量分析通量较低。还有，由于黄龙病菌在柑橘植株内含量低且分布不均，因此锚定柑橘体内黄龙病菌DNA片段的分子检测技术，比如PCR方法等，在用于检测时就会出现假阴性，尤其对于早期感染黄龙病菌但尚未表现症状的柑橘树，经常出现检测结果假阴性。因此在黄龙病早期诊断上，亟需一种更为准确的检测方法。

因此，实时荧光定量PCR已不能完全满足黄龙病高灵敏度定量检测的需求。

【发明内容】

针对现有技术中实时荧光定量PCR已不能完全满足黄龙病高灵敏度定量检测、以及针对黄龙病早期感染阶段检测准确率低的问题，本发明提供了一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，本方法利用液质联用仪结合非靶向代谢组学技术检测植株内叶片代谢物在韧皮部杆菌侵染后的变化情况，根据多元分析判别是否感染黄龙病菌，在无症状阶段检出黄龙病菌，弥补现有黄龙病PCR检测技术的不足，具有准确率高、自动化程度高等优势，能尽早发现黄龙病植株，挽回经济损失。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于液质联用非靶向分析技术的柑橘黄龙病检测方法，该方法是将柑橘叶片机械匀浆，然后采用溶剂萃取，萃取后的固液混合物通过离心分离得到上清液，上清液过滤后进入超高效液相色谱-电喷雾-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Esi-Qtof-MS，LC-MS)检测并获得实验数据，所得数据经过峰识别、归一化、保留时间校正等预处理，最后利用PCA等统计手段，通过对比健康样品，诊断是否感染黄龙病。

所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，包括如下步骤：

1)柑橘样品代谢产物的提取；以甲醇溶液为溶剂浸提柑橘叶片代谢产物，得到供试品；

2)非靶向代谢组学分析；采用LC-MS联用技术对柑橘叶片代谢产物提取液进行非靶向成分测定，得到原始数据；

所述的LC-MS的检测器为四级杆飞行时间质谱、四级杆轨道阱质谱或三重四极杆线性离子阱质谱；

所述的LC-MS的检测器中的色谱条件为：流动相分别为水、甲醇或乙腈；总流速为0.1-0.8mL/min；洗脱方法为梯度洗脱，条件为0-10min，5％-10％；10-19min，10％-30％；19-23min，30-32％；23-30min，32％-50％；30-31min，50-95％；31-35min，95-95％；各数值参数在±5％的范围内波动；

所述的LC-MS的检测器中的电喷雾离子源和四级杆飞行时间质谱条件为：

正离子模式扫描：干燥气温度：325℃；鞘气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；鞘气流速：11L/min；碎裂电压140V；雾化气压力：50psi；MS扫描范围：m/z 100-1000；毛细管电压4000V；喷嘴电压1000V；锥孔电压60V；八极管电压750V；

负离子模式扫描：干燥气温度：325℃；鞘气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；鞘气流速：11L/min；碎裂电压140V；雾化气压力：50psi；MS扫描范围：m/z 100-1000；毛细管电压3500V；喷嘴电压1000V；锥孔电压60V；八极管电压750V；以上各数值参数在±15％的范围内波动。

3)数据的处理与分析；对原始数据依次进行预处理和多元统计学分析；

4)数据挖掘发现差异性代谢物，以显著性差异、倍数差异和变量重要性投影指标筛选差异性代谢物。

本发明中：

步骤1)所述的柑橘样品代谢产物的提取，是准确称取柑橘叶片10-500mg于离心管中，加入10-80％体积浓度的甲醇或乙腈溶液1-50mL和研磨珠一颗，45Hz匀浆研磨90s，随后在4-50℃下超声辅助提取10-50min，提取完成后4℃下14000rpm离心15min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，准备上机测试。

步骤2)所述的非靶向，是无偏差地检测上机样品中的所有代谢物成分，分析黄龙病菌侵染对柑橘叶片代谢物的影响，从整体判断植株是否感染黄龙病。

步骤2)中所述的LC-MS的色谱柱，选自C8、ODS或T3中的一种。

步骤3)中所述的对原始数据进行预处理，是对LC-MS采集获得的数据文件，通过XCMS online、MassProfinder、MSdial、MZmine2网站或软件进行峰识别、峰对齐、保留时间校正、峰面积提取、归一化等步骤后才能进行下一步分析。

步骤3)中所述的对原始数据进行多元统计学分析，利用Simca-p、Excel、SPSS等软件分析统计经过预处理后的LC-MS采集获得的数据，包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)和Student’s t-test中的一项或多项；

通过OPLS-DA得分图观察健康组和无症状组的组内聚集和组间分离程度，判断样品是否感染黄龙病，OPLS-DA判别模型的三个预测参数R²(X)、R²(Y)及Q2均需要大于0.5。

步骤4)中所述的差异代谢物的筛选条件为满足变量投影重要性VIP＞1.5，显著性P＜0.05，倍数差异FC＞2或＜0.5。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，是一种基于液质联用的非靶向代谢组学检测技术，通过分析黄龙病菌侵染对柑橘叶片代谢产物的影响，区分健康植株和无症状感染植株，本发明所述的方法提取柑橘叶片的化学成分后送入超高效液相色谱-电喷雾-四级杆飞行时间质谱分析，下机数据经过预处理后，利用正交偏最小二乘法判别分析得分图等统计手段区分出健康植株和带病植株的差异；本发明首次将高分辨LCMS技术应用于柑橘黄龙病的非靶向分析，尤其适合黄龙病感染早期无症状阶段的诊断，通过对叶片代谢物进行无偏向分析，可大幅提高早期黄龙病侵染阶段的植株检出率，对田间采集到的无症状样品，能有效检测出无症状感染阶段柑橘植株体内的黄龙病菌，检出率超过80％。

2、本发明所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，在侵染早期，黄龙病菌在柑橘植株中的分布不均匀，现有的PCR技术无法有效检测到病原菌的基因片段，本发明的LC-MS结合非靶向代谢组学的检测方法则绕过了这一瓶颈，通过分析病原菌诱导寄主调控次级代谢产物这一相互作用，区分出健康植株和带病植株。

3、本发明所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，既可独立开展黄龙病的检测，也可搭配现有的PCR技术，对PCR检测结果呈阴性的样品进行复检，提高检测可靠性；本发明所述的方法可有效提升柑橘黄龙病检测的准确性，保障柑橘产业健康高质量发展。

【附图说明】

图1是本发明实施例的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法中健康组、黄龙病无症状组的PCA得分图。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例：

一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，包括如下步骤：

柑橘叶片样品采集于广西桂林、南宁的沙糖橘果园；CK为健康叶片，包括以下样品：E1、E2、E3、E4、E5、E6，HLB为已确定感染黄龙病植株上的未显症叶片，包括以下样品：A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4、D5、F1、F2、G1；

(1)准确称取沙糖橘叶片100mg于离心管中，加入10％甲醇溶液1mL和研磨珠一颗，45Hz匀浆研磨90s，随后在4℃下超声辅助提取30min，提取完成后4℃下14000rpm离心15min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，准备上机测试；

(2)UPLC洗脱条件为：

0-10min，5％-10％；

10-19min，10％-30％；

19-23min，30-32％；

23-30min，32％-50％；

30-31min，50-95％；

31-35min，95-95％；

(3)电喷雾四级杆飞行时间质谱条件为：正模式扫描；干燥气温度：325℃；鞘气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；鞘气流速：11L/min；碎裂电压140V；雾化气压力：50psi；MS扫描范围：m/z 100-1000；MS/MS扫描范围：m/z 80-1000；毛细管电压4000V；喷嘴电压1000V；锥孔电压60V；八极管电压750V；

负模式扫描；干燥气温度：325℃；鞘气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；鞘气流速：11L/min；碎裂电压140V；雾化气压力：50psi；MS扫描范围：m/z 100-1000；MS/MS扫描范围：m/z 80-1000；毛细管电压3500V；喷嘴电压1000V；锥孔电压60V；八极管电压750V；

(4)LCMS下机数据的处理方法：采用XCMS进行峰对齐、峰提取、归一化等操作；

(5)统计分析方法：利用Simca-p 14.1软件处理过后的下机数据进行PCA、PLS、OPLS-DA分析，通过PCA得分图观察健康组和无症状组的组内聚集和组间分离程度，PCA模型的三个预测参数R²(X)、R²(Y)及Q²均需要大于0.5；

对比例：

利用常规PCR法检测是否感染黄龙病

(1)主要仪器

N9548型研磨器，北京赫得公司；Sientific 18800A-1CEQ型恒温水浴锅，ThermoFisher公司；Sigma 3-30ks型冷冻离心机，Sigma公司；NanoDropTM OneC微量紫外可见分光光度计，ThermoFisher公司；S1000型PCR仪，Gel DocXR凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；

(2)引物和试剂

采用的检测引物为

TR2-PCDR-F(5'-TGTCCATATGATCTTCGATAATGCGAG-3')/TR2-PCDR-1R(5'-AGGGTGGATTAGATCGTTTTCTCTCAA-3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

采用的提取试剂为Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、EDTA缓冲液(pH 8.0)、四甲基乙二胺二钠盐(EDTA-Na2)、硼酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、山梨糖醇(Sorbitol)、氯化钠(NaCl)、溴化十六烷三甲基铵(CTAB)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、3M醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，均由Sigma公司生产；酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)、氯仿：异戊醇(24:1)，由北京索莱宝科技有限公司生产；采用的检测试剂为SD Polymerase检测试剂盒，由德国拜耳公司生产；

(3)柑橘叶片中脉组织DNA的提取

采集的叶片样品分别用清水冲净后再用吸水纸擦干，剥取叶片中脉并用一次性刀片切成小段，取约100mg的中脉组织放入2mL离心管中，加入1mL植物DNA提取缓冲液与1个钢珠，使用研磨机磨成匀浆，14000rpm离心5min后倒去上清液，依次加入300μL DNA提取缓冲液(20mmol/L EDTA pH 8.0、350mmol/L Sorbitol、100mmol/L Tris-HC1 pH 8.0)、300μL裂解缓冲液(50mmol/L EDTA pH 8.0、2mol/L NaCl、20g/L CTAB、200mmol/L Tris-HCl pH8.0)、200μL质量浓度为50g/L的sarcosy，涡旋混匀，65℃水浴45min后加入800μL酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，v/v/v)，充分涡旋混匀，14000rpm，25℃离心10min；移取上清液到一干净的2mL无菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇(24:1，v/v)，充分涡旋混匀，14000rpm，25℃离心10min；取上清液到一干净的2mL无菌离心管中，依次加入2倍于上清液体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10倍于上清液体积的3mol/L醋酸钠，轻轻翻转离心管10次后，-20℃下静置1h，然后进行14000rpm，4℃离心15min；倒掉离心管内液体，加入lmL于-20℃预冷的70％乙醇，轻轻翻转离心管5次，14000rpm，4℃离心5min；再次倒掉离心管内液体，加入lmL于-20℃预冷的70％乙醇，轻轻翻转离心管5次，14000rpm，4℃离心5min；倒掉管内液体后，室温下晾干离心管，然后加入50μL 1×TE buffer溶解DNA，用紫外可见分光光度计测定DNA浓度后，将提取的DNA浓度调节到100ng/uL；

(4)常规PCR检测法

采用的引物对为

OI1(5'-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3')/OI2c(5'GC-CTCGCGACTTCGCAACCCAT-3')，反应体系为25μL：10×PCR buffer 2.5μL、15mmol/L MgCl₂ 2.5μL、2.5mmol/L dNTPmixture 2.0μL、5μmol/L上下游引物各2μL、5U/μL热启动Taq DNA聚合酶0.2μL、阳性DNA模板1μL，补足ddH2O至25μL；扩增程序为：94℃5min；94℃45s，68℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min；扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，有1160bp大小扩增产物的为黄龙病菌阳性样品。

结果与总结：

表1.砂糖橘样品的PCR检测结果和代谢组检测结果

HLB组的18个样品均来自已经确定感染黄龙病的砂糖橘植株上未显症状叶片，由表1可知，常规PCR法对该组的检出率为5.56％，而本发明所述方法则为83.33％，提升明显，这表明本发明所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法对无症状的柑橘黄龙病叶片具有良好的诊断效果。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，做出若干改进和变化，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）柑橘样品代谢产物的提取；准确称取柑橘叶片10-500mg于离心管中，加入10-80%体积浓度的甲醇或乙腈溶液1-50mL和研磨珠一颗，45Hz匀浆研磨90s，随后在4-50℃下超声辅助提取10-50min，提取完成后4℃下14000rpm离心15min，上清液通过0.22μm滤膜过滤，准备上机测试；

2）非靶向代谢组学分析；采用LC-MS联用技术对柑橘叶片代谢产物提取液进行非靶向成分测定，得到原始数据；

所述的LC-MS的检测器中的色谱条件为：流动相分别为水、甲醇或乙腈；总流速为0.1-0.8mL/min；洗脱方法为梯度洗脱，条件为0-10min，5%-10%；10-19min，10%-30%；19-23min，30-32%；23-30min，32%-50%；30-31min，50-95%；31-35min，95-95%；各数值参数在±5%的范围内波动；

负离子模式扫描：干燥气温度：325℃；鞘气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；鞘气流速：11L/min；碎裂电压140V；雾化气压力：50psi；MS扫描范围：m/z 100-1000；毛细管电压3500V；喷嘴电压1000V；锥孔电压60V；八极管电压750V；以上各数值参数在±15%的范围内波动；

3）数据的处理与分析；对原始数据依次进行预处理和多元统计学分析；所述的对原始数据进行多元统计学分析，利用Simca-p、Excel、SPSS软件分析统计经过预处理后的LC-MS采集获得的数据，包括主成分分析PCA、偏最小二乘法判别分析PLS-DA、正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA和Student’s t-test中的一项或多项；

通过OPLS-DA得分图观察健康组和无症状组的组内聚集和组间分离程度，判断样品是否感染黄龙病，OPLS-DA判别模型的三个预测参数R²(X)、R²(Y)及Q2均需要大于0.5；

4）数据挖掘发现差异性代谢物，以显著性差异、倍数差异和变量重要性投影指标筛选差异性代谢物，所述的差异代谢物的筛选条件为满足变量投影重要性VIP＞1.5，显著性P＜0.05，倍数差异FC＞2或＜0.5。

2.根据权利要求1所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，其特征在于：步骤2）所述的非靶向，是无偏差地检测上机样品中的所有代谢物成分，分析黄龙病菌侵染对柑橘叶片代谢物的影响，从整体判断植株是否感染黄龙病。

3.根据权利要求1所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，其特征在于：步骤2）中所述的LC-MS的色谱柱，选自C8、ODS或T3中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种基于液质联用非靶向分析的柑橘黄龙病检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的对原始数据进行预处理，是对LC-MS采集获得的数据文件，通过XCMS online、MassProfinder、MSdial、MZmine2网站或软件进行峰识别、峰对齐、保留时间校正、峰面积提取、归一化步骤后再进行下一步分析。