CN105572212A - 一种基于可视化质谱信息的生晒参和红参快速识别方法 - Google Patents

Abstract

一种基于可视化质谱信息技术的生晒参和红参快速识别方法。包括步骤：首先对样本进行色谱-质谱分析，获取样本中化合物的质荷比m/z，保留信息t和质谱信号强度I；以m/z和t为坐标，画出样本的质量-时间图，每个可测化合物在该图中均有特定的空间位置，化合物的质谱信号强度以点的色度值表示；从m/z-t-I图像中抽提轮廓信息等空间信息，发现了能够快速准确识别生晒参和红参提取物的特征轮廓信息，可用于这类药材或对应产品的快速识别。本发明突破了常规的理化鉴别或指纹谱等分析方法，充分利用了由复杂样本中各个化合物质量特征所形成的空间信息，大大提高了样本识别能力，对于生晒参和红参的甄别具有重要应用前景。

Description

一种基于可视化质谱信息的生晒参和红参快速识别方法

技术领域

本发明涉及一种基于可视化质谱信息技术的生晒参和红参的快速识别方法。

背景技术

生晒参和红参均来源于伞形目五加科人参属，属于名贵中药材，广泛用于药品和食品领域，具有重要的医疗价值和经济价值。生晒参、人参叶、红参都来自于人参属的人参(PanaxginsengC.A.Mey.)。人参大补元气，主产于东北。红参是由人参经过浸润、蒸制、烘干等工序加工而成，与人参的成分非常接近，但补益作用更加明显。上述药材所含成分相近，在切片、粉碎后或制剂后非常难于区分，因此存在着混用和冒用的现象。

现在常用的方法是利用高效液相色谱法测定皂苷的种类或含量，来辅助确定药材的种类。同时还有一些科研人员利用高效液相色谱法对生晒参制剂和饮片中的成分进行了分离测定。利用高效液相色谱法标示出生晒参药材指纹图谱中的18个共有峰并且测定其相似度。1990年，美国的Williams和Welsh两个研究小组提出了PAPD技术(随机扩增的多态性DNA)，它是以任意顺序列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行随机扩增，采用该技术能够获得清晰的多态性DNA指纹图谱，可以清楚地区分易混的中药材[10]。现在，国内已有很多学者采用分子鉴别技术来对生晒参进行鉴别。如罗志勇等采用扩增片段长度多态性DNA(AFLP)法，将生晒参干燥根的基因组DNA经EcoRI/Msel酶切，并与相应的人工接头连接后，使用选择性引物进行PCR扩增，经过变性聚丙酰胺凝胶电泳检测，成功地构建出重复性好的生晒参的DNA指纹图谱。

在人参生晒参和红参的识别领域，所报道的相关专利有：1)一种用于原产地生晒参保护的hplc指纹图谱鉴别方法(CN101419200B)；2)一种生物品种基因组DNA指纹图谱(CN1144880C)：根据DNA指纹图谱的特征，建立DNA指纹数据库，对待鉴定生物品种与标准生物品种DNA指纹图谱和数据进行自动比较和判别分析，明确待鉴定生物品种。与这些专利相比，本发明能够提供全面的药材代谢物信息和能够识别不同药材的关键区域信息，方法直接。高效，对于这类已混药材的识别具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种快速识别生晒参和红参快速识别方法，本发明改变传统的方法，从药材的色谱-质谱信息转化为m/z-t-I图像，体现各个化合物的质量差异，通过识别图像的轮廓和纹理等空间信息，提高识别生物样本的效率，其特征在于构建生物样本中的质谱信息所组成的图像，对图像进行识别，依次对样本进行分类。按以下步骤进行：

1)对生晒参和红参药材利用适当的溶剂进行提取和处理，获取样本中的化合物。

2)利用色谱-质谱仪，对样本进行在线的色谱分离和质谱检测，获取每一个化合物的色谱如色谱保留时间和峰面积，和质谱信息如质荷比。

3)将原始质谱数据导入到软件，去除噪音信号，获取样本中每个化合物的m/z,t和I值,产生m/z-t-I数据矩阵，绘制出样本的m/z-t-I图型(或图像)，每个可测化合物具有特定的质量和时间坐标，化合物的质谱信号强度以峰值或以点的色度值表示。

4)对m/z-t-I图像进行识别，从图像中寻找离子聚集的区域，分辨其轮廓，发现样本的图像特征，进行不同样本之间的比较。通过对m/z-t-I图像的比对分析，发现生晒参的特征图像信息(图1)。

通过对m/z-t-I图像的比对分析，获取红参的特征图像信息(图2)。

5)通过对比分析，发现可用于用于快速区分生晒参和红参的特征信息。

本发明为识别易混淆的生晒参和红参提供一个更加有力的工具，本发明总结：

1.本发明采用采用图像处理技术，将样本中各个化合物之间的质量和保留时间的关联性转化为空间关系。通过全面利用生晒参和红参中各个化合物的质量信息，而不需要对各个化合物进行鉴定，能够大大提高识别效率。

2.与常用于分类的指纹图谱法指纹图谱法、质谱指纹图谱法相比，本发明增加了分离这一维度，具有更高的分辨率和识别效率。

3.本发明更充分利用了各个化合物之间的质量的相关性，比较的过程简单且直接，特别适合生晒参和红参原材或加工物的快速与准确鉴别。

本发明突破了常规的理化鉴别或指纹谱等分析方法，充分利用了由复杂样本中各个化合物质量特征所形成的空间信息，大大提高了样本识别能力，对于生晒参和红参的甄别，或含此类药材中药(食品)的生产和质量控制具有重要应用前景。

附图说明

图1生晒参的m/z-t-I图像。

图2红参的m/z-t-I图像。

图3生晒参和红参的特征信息。

图4不同药材的m/z-t-I图像特征对比。

具体实施方式

现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实验例1：标准药材人参和红参的对比分析

1)中药样品溶液的制备：精密称取各标准药材干燥粉末各100mg，每份药材粉末加入50％甲醇1ml，超声提取15min，离心5min,取上清液，重复提取1次，合并两次上清液过0.22um滤膜。

2)超高效液相色谱-质谱联用分析：样品全谱分析采用Agilent1290超高效液相色谱系统(Agilent，Waldbronn，Germany)串联6520Q-TOF-MS(AgilentCorp，USA)。实验采用Agilent公司ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱(3.0*150mm,1.8um)，流动相A相为水(0.5％乙酸)，B相为乙腈，梯度洗脱：0-15min，B相5％-100％，15-20min，B相保持100％，20-21min，B相100％-5％，21-25min，B相保持5％，流速为0.4ml/min。柱温为40℃，进样量为5uL。质谱采用ESI离子源，负离子模式采集数据。数据采集范围m/z100-1500。温度为350℃，干燥器流速8L/min，雾化气压力40psi，毛细管电压3500V，Fragmentor电压200V，skimmer电压65V。质谱采用加入内标程序。(TOF——refmass——Enable——usebottleA(nebulizer设为3psi)。

3)利用XC-MSonline软件，对获取的数据进行对齐，去除质谱噪音，获取m/z，t和I信息的数据矩阵，以CSV文件格式存储。

4)将生晒参和红参的数据矩阵转化为m/z-t-I图像(见图3)。

5)生晒参和红参的m/z-t-I图显示出相似性和局部的差异性。

红参和人参相似，在三个椭圆形区域内均有大量离子的存在，但区域内化合物的数量和种类发生改变。另外，出现了一个特征区域(方框内)，该区域包含一群高丰度的化合物，这些化合物的色谱保留时间介于9.8-13.1分钟之间，m/z值介于760-910之间。这一区域可用于区分标准药材人参和红参。

实验例2：未知样品的快速识别

1)中药样品溶液的制备：将标准药材生晒参和红参粉碎后各取干燥粉末100mg，每份药材粉末加入50％甲醇1ml，超声提取15min，离心5min,取上清液，重复提取1次，合并两次上清液过0.22um滤膜，同法提取黄芪和合欢花，利用双盲法实验，四种药品分别给出编号1、2、3和4。

2)超高效液相色谱-质谱联用分析：样品全谱分析采用Agilent1290超高效液相色谱系统(Agilent，Waldbronn，Germany)串联6520Q-TOF-MS(AgilentCorp，USA)。实验采用Agilent公司ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱(3.0*150mm,1.8um)，流动相A相为水(0.5％乙酸)，B相为乙腈，梯度洗脱：0-15min，B相5％-100％，15-20min，B相保持100％，20-21min，B相100％-5％，21-25min，B相保持5％，流速为0.4ml/min。柱温为40℃，进样量为5uL。质谱采用ESI离子源，负离子模式采集数据。数据采集范围m/z100-1500。温度为350℃，干燥器流速8L/min，雾化气压力40psi，毛细管电压3500V，Fragmentor电压200V，skimmer电压65V。质谱采用加入内标程序。(TOF——refmass——Enable——usebottleA(nebulizer设为3psi)。

3)利用XC-MSonline软件，对获取的数据进行对齐，去除质谱噪音，获取m/z，t和I信息的数据矩阵，以CSV文件格式存储。

4)将各个药材的数据矩阵转化为m/z-t-I图像(见图4)。

5)从m/z-t-I图像中，能够快速正确区分出1号为生晒参，二号为红参。

红参和人参相似，在三个椭圆形区域内均有大量离子的存在，但区域内化合物的数量和种类发生改变。另外，出现了一个特征区域(方框内)，该区域包含一群高丰度的化合物，这些化合物的色谱保留时间介于9.8-13.1分钟之间，m/z值介于760-910之间。这一区域可用于区分标准药材人参和红参。

Claims (4)

1.一种基于可视化质谱信息的生晒参和红参快速识别方法，其特点在于：把常规的质谱信号图转化为由化合物质量信息(m/z)、色谱保留时间(t)和信号强度(I)所表示的图像，针对该图像进行分析，提取生物特征，对样本进行分类；按以下步骤进行：

1)对待测生晒参和红参药材样品利用溶剂进行提取和处理，获取样本中的化合物；

2)利用色谱-质谱仪，对样本中的化合物进行在线的色谱分离和质谱检测，获取其中每一个化合物的色谱信息中的色谱保留时间和峰面积，和质谱信息中的质荷比；

3)将原始质谱数据导入到质谱仪器自带软件或第三方软件，去除噪音信号，获取样本中每个化合物的m/z、t和I值,产生m/z-t-I数据矩阵；以m/z和t为横纵坐标，绘制出样本的m/z-t图，化合物的质谱信号强度以坐标点的色度值在m/z-t图进行标示，绘制出样本的m/z-t-I图型或图像，每个可测化合物具有特定的质量和时间坐标，化合物的质谱信号强度以峰值或以点的色度值表示；

4)生成的m/z-t-I图像适用于对比识别，可直接从生晒参和红参图像中抽提空间信息，空间信息包括轮廓信息、纹理信息或色度信息中的一种或二种以上；通过空间信息进行生晒参和红参样本的识别和判断；

若待测样品为生晒参，应具有下述空间信息：生晒参m/z-t-I图中在m/z500-1500之间有三个特征轮廓区，第一个特征区域的坐标特征是色谱保留时间介于7-10分钟之间，m/z值介于473-700之间，第二个椭圆形区域内的坐标特征是色谱保留时间介于5.5-7分钟之间，m/z值介于780-1150之间；第三个椭圆形区域内的坐标特征色谱保留时间介于7.5-10分钟之间，m/z值介于800-1450之间；

若待测样品为红参，应具有下述空间信息：红参m/z-t-I图中在m/z500-1500之间有四个特征轮廓区，除红参中所显示的三个相同区域外，另有一个方形区域，该区域包含一群的化合物，这些化合物的色谱保留时间介于9.8-13.1分钟之间，m/z值介于760-910之间；

方形区域是区分红参和生晒参的特征区域，可用于快速区分两种人参。

2.根据权利要求1所述的基于质谱信息的生物特征图像识别方法，其特征是：质谱数据是在负离子模式下采集，能够实现对人参中皂苷等化合物检测。

3.根据权利要求1所述的基于质谱信息的生物特征图像识别方法，其特征是：原始的质谱数据转化为m/z-t-I图像，体现药材中各个化合物之间的质量特性。

4.根据权利要求1所述的基于质谱信息的生物特征图像识别方法，其特征是：寻找生晒参和红参质谱图像之间的差异性，该差异性的发现可借助于计算机分析，统计出只在一种人参中存在的点簇，或在两种人参中含量差异显著的点簇，以此类点簇所在区域作为识别或区分两类人参的特征区域。